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上海源葉生物科技有限公司
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單分子FISH技術實現轉錄組研究的突破
2013-11-8 閱讀(491)
分析基因表達，我們有很多選擇：qPCR、芯片和RNA-Seq。然而，大多數表達分析往往只關注一個參數：轉錄本豐度。它們既不能提供空間信息，即特定RNA位于何處；也不能確定細胞之間表達水平的差異，因為細胞群體的研究讓這一信息丟失。
原位雜交（ISH）這種顯微鏡方法解決了這兩個問題。它利用標記的核酸探針來確定組織及細胞中DNA或RNA的空間位置和豐度。這種方法有兩種形式，熒光（FISH）和顯色（CISH）。之前，FISH和CISH一直是定性的：要么陽性，要么陰性。隨著技術的發展，定量版本也被開發出來。
單分子熒光原位雜交（smFISH）是一種新的基因表達分析方法，能報告轉錄本豐度和空間定位。但到目前為止，smFISH還不能實現基因組范圍的分析。如今，瑞士蘇黎世大學的研究人員報告了一種策略，讓smFISH也插上高通量的翅膀。1
蘇黎世大學分子生命科學研究所的Lucas Pelkmans領導了這項研究。他解釋道，傳統的smFISH有兩個主要缺點，阻礙了它的高通量應用。首先，它產生相對較弱的信號，信噪比不太高。其次，它不能擴展，因為它需要高的放大倍數，長的成像時間，并且每個轉錄本的條件需要優化。
傳統的smFISH利用一系列短的寡核苷酸來檢測轉錄本，每個寡核苷酸上標記有一個熒光基團。這樣，mRNA上就有足夠濃度的熒光分子，產生可見的光點，但通常只有在60x或100x放大倍數下，使用油浸、大數值孔徑的透鏡才行。
Pelkmans及其團隊以支鏈DNA（branched DNA）為基礎開發了他們的方法。在這一策略中，15對寡核苷酸探針靶定一個特定的mRNA。這些探針將作為一級preamplifier探針的著陸墊，又為一些二級的amplifier探針提供了結合位點，zui后是一組三級的標記探針。
Pelkmans解釋道，這就像在轉錄本上種下了15顆雜交探針的樹。這種方法產生了放大的信號，亮度增加100倍，信噪比也提高3倍，而成像時間比傳統方法大大縮短。
憑借這種強烈的信號，研究小組將實驗過程自動化。他們建立了928個人類基因的支鏈DNA庫，并用培養的HeLa細胞進行了檢驗。在這一過程中，他們使用384孔板，每孔用一個探針，并使用相同的雜交和洗滌條件。雜交之后，他們以40x放大倍數對每孔中約1萬個細胞進行成像，并利用內部開發的算法來提取轉錄本豐度和空間特征，例如，斑點靠近細胞膜，還是細胞核，集中還是分散。他們總共收集了18個空間變量，并利用計算機集群來評估它們與基因調控的關系。
數據表明，那些表現出相似的空間特征和相似的細胞間差異的基因，也更有可能具有相似的功能作用。
“事實證明，那些空間特征實際上提供了更多信息，可預測基因之間的功能性相互作用，”Pelkmans解釋道。
大家都認為，單細胞水平的轉錄充滿噪音。也就是說，細胞質中兩個遺傳上*相同的細胞可能有著*不同的轉錄本數量。然而，蛋白水平不一定反映這種轉錄本豐度。Pelkmans認為，生物過程的可靠性有可能源于mRNA亞細胞定位的調節，而他們的數據也支持這一觀點。如今，他們的目標是直接檢驗這一假說，以確定“轉錄本的空間結構是否緩沖了轉錄噪音”。
霍華德•休斯醫學研究所的項目科學家Timothee Lionnet認為這項研究是“自動化的力作”。他談道：“他們將FISH技術帶到了多重PCR或RNA-Seq技術所達到的通量。”
據Lionnet介紹，這項技術的一個明顯延伸是多重檢測每個細胞中的多個轉錄本。兩家推出支鏈DNA技術的公司，Affymetrix和Advanced Cell Diagnostics，目前已經提供多重的FISH探針。據Life Technologies介紹，它將在11月開始銷售ACD的smFISH試劑。
之前，加州理工學院的化學家蔡龍（Long Cai）也介紹了一種超分辨率條形碼技術，能檢測每個細胞中32個不同轉錄本2。他們利用smFISH技術將單個mRNA與包含*熒光基團組合的寡核苷酸探針進行了雜交，隨后利用超分辨率顯微鏡計數了這些熒光條形碼mRNA。
Pelkmans的團隊觀察到總體上與RNA-Seq的數據有著良好的一致性，但每個細胞的轉錄本數量沒那么高。他們稱之為“天花板效應”。此外，這種技術還不能有效檢測核轉錄本，不過研究人員在固定液中加入乙酸，能減輕這種影響。
