高效液相色譜儀主要有：進樣系統、輸液系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統組成。

1.進樣系統

一般采用：隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作，進樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的。

2.輸液系統

該系統包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l.47～4.4×107Pa流速可調且穩定，當高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應，可加快其在柱中的移動速度，這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存錯和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強度、pH值或改用。

3.分離系統

該系統包括：色譜柱、連接管和恒溫器等。

色譜柱一般長度為10～50cm（需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管）內徑為2～5mm，由優質不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，柱內裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質和固定液構成），固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或硅膠構成，它們都有惰性（如，硅膠表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性和比表面積大的特點，加之其表面經過機械涂漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣）或者用化學法偶聯各種基因（如，磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機化合物。

因此，這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性，例如，在多孔性硅膠表面偶聯豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。

另外，固定相基質粒小，柱床極易達到均勻、致密狀態，極易降低渦流擴散效應。基質粒度小、微孔淺，樣品在微孔區內傳質短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據柱效理論分析，基質粒度小，塔板理論數N就越大。

這也進一步證明基質粒度小，會提高分辨率的道理。再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調到60℃通過改善傳質速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。

4.檢測系統

高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種：

(1)紫外檢測器

該檢測器適用于對紫外光(或可見光)有吸收性能樣品的檢測。

其特點：使用面廣（如，蛋白質、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；靈敏度高（檢測下限為10-10g/mL）；線性范圍寬；對溫度和流速變化不敏感；可檢測梯度溶液洗脫的樣品。

(2)示差折光檢測器

凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測；糖類化合物的檢測使用此檢測系統。這一系統通用性強、操作簡單，但是，靈敏度低（檢測下限為10-7g/mL），流動相的變化會引起折光率的變化；因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測。

(3)熒光檢測器

凡具有熒光的物質，在一定條件下，其發射光的熒光強度與物質的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用于具有熒光的有機化合物（如，多環芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質等）的測定，其靈敏度很高（檢測下限為10-12～10-14g/mL）痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可采用。

5.數據處理系統

該系統可對測試數據進行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。