YIJI 組織磷酸二酯酶總活性酶連續循環光度法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

YIJI組織磷酸二酯酶（PDE）總活性酶連續循環光度法定量檢測試劑是一種旨在通過磷酸二酯酶、肌激酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的酶連續反應系統中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光度法來測定組織裂解樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解懸液樣品（動物、人體、昆蟲等）環核苷酸依賴性（包括cAMP或cGMP）磷酸二酯酶的總活性，以及抑制劑和調節劑檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

磷酸二酯酶（phosphodiesterase；PDE；EC3.1.4.17 ），又稱為環核苷酸磷酸二酯酶（cyclic nucleotide phosphodiesterase），包括腺苷-3',5'-環化一磷酸（cyclic adenine monophosphate；cAMP）或鳥苷-3',5'-環化一磷酸（cyclic guanine monophosphate；cGMP）。通過水解環核苷酸（cAMP或cGMP）的磷酸二酯鍵（phosphodiester?bond）產生5’-核苷（5’-nucleotides），使環核苷酸失活，達到調控第二信使分子環核苷酸的水平。其中環腺苷酸（cAMP）是存在于所有生命體細胞內重要的第二信使，以調節細胞形態、生長、分化、炎癥、蛋白磷酸化、基因轉錄等各種功能。基于氨基酸序列、底物特異性、調節特征、組織分布和藥理特性等，磷酸二酯酶家屬分為11種亞酶，例如PDE4/7/8是cAMP為底物；PDE5/6/9是cGMP為底物；PDE1/2/3/10是cAMP/cGMP為底物等，具有不同的生化特性、組織表達特異性和通路特征。 磷酸二酯酶與勃起障礙（erectile dysfunction）、哮喘、慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease；COPD）、學習障礙、情緒抑郁和記憶功能、神經退行性病變、自動免疫性疾病、心衰和心肌梗塞等疾病有關。基于環核苷酸在磷酸二酯酶的作用下，產生為1－磷酸腺苷產物后，通過肌激酶（myokinase）、 丙酮酸激酶（pyruvate kinase）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase）系統，測定還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）的吸光峰值的變化（340nm 波長），來定量分析磷酸二酯酶的總活性。磷酸二酯酶連續循環反應系統為：

產品內容

YIJI清理液（Reagent A）   毫升

YIJI裂解液（Reagent B）   毫升

YIJI緩沖液（Reagent C）   毫升

YIJI反應液（Reagent D）   微升

YIJI酶促液（Reagent E）        微升

YIJI底色液（Reagent F）    微升

YIJI陰性液（Reagent G）    微升

產品說明書  1份

保存方式

保存YIJI清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里；YIJI底色液（Reagent F）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

臺式離心機：用于樣品操作

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析的容器

分光光度儀或酶標儀：用于光度分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的YIJI裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

• 樣品準備
• 手術取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過ye
• 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入置于冰槽里的xx微升YIJI裂解液（Reagent B） 
• 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 放進冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存備用）
• 即刻放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g 
• 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
• 測定準備
• 開啟并設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長340nm，間隔60秒，讀數15次（共15分鐘），并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；YIJI底色液（Reagent F）避免光照
• YIJI緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
• 背景對照測定
• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI反應液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底色液（Reagent F）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent G）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（0分鐘讀數－15分鐘讀數）
• 樣品測定
• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI反應液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底色液（Reagent F）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入10微升待測樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（0分鐘讀數－15分鐘讀數） 

五、計算樣品活性

• 酶標儀測定

• 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 分別加入xx微升YIJI反應液（Reagent D）到相應孔里
• 分別加入xx微升YIJI酶促液（Reagent E）到相應孔里
• 分別加入xx微升YIJI底色液（Reagent F）
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入xx微升YIJI陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和15分鐘讀數
• 活性計算

注意事項

• 本產品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，至關重要 
• 樣品中避免使用EDTA和EGTA等
• 加樣后3秒內光度測定
• 測定值由高到低變化；測定持續15分鐘
• 光度測定后，比色皿須清洗*
• 樣本測定0分鐘讀數高于15分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/10微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供 YIJI Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－YJ30030.1） 
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 磷酸二酯酶單位活性定義為：在30℃，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠水解1微摩爾環核苷酸（cAMP或cGMP）至5’-核苷（5’-nucleotides）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列磷酸二酯酶檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感