YIJI 線粒體呼吸鏈復合物 V 活性光譜法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

YIJI 線粒體呼吸鏈復合物 V（F0F1-ATP 酶/ATP 合成酶）活性光譜法定量檢測試劑是一種旨在使用丙

酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環法反應系統，測定與 ATP 合成對應的 ATP 水解產生 ADP 過程中，伴隨的

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光譜法測定樣品中酶活性的

而經典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種純化線粒體樣品（動

物、人體、酵母）以及細胞或組織裂解懸液樣品的 F0F1-ATP 酶/ATP 合成酶的特異性活性檢測。可用于心

肌、能量代謝、蛋白組學、病理生理學、神經病變等研究。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，

操作簡捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。

技術背景

線粒體呼吸鏈復合物V，通常稱為ATP合成酶（ATP synthase） F型ATP酶 type ATPase）、（F和F1F0 ATP酶（F1F0

ATPase），是線粒體氧化磷酸化的*反應。其分子量為500KD，含有十六個亞單位，其中兩個：ATP酶6

和8為線粒體DNA編碼的。ATP酶主要有兩個結構域：F0為質子通道，由幾個膜蛋白構成，包括a、b、c、d、

e、F6、A6L、OSCP（oligomycin sensitive conferring protein）等；和F1催化活性結構域，由水溶性的α3β

3γδε蛋白構成。其zui特征性的酶活性是寡霉素敏感的ATP合成酶。復合物V的主要功能在于產生大部分

細胞所需的能量ATP。ATP的合成需要線粒體內膜電子傳遞到氧分子時，呼吸鏈蛋白所產生的質子梯度變化。

質子通過F0結構域傳遞到基質，激活F1催化活性結構域，促使ATP合成。該酶異常會導致心肌和神經系統

疾病。基于ATP，在寡霉素參與下，受到F1F0 ATP酶的水解，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）

和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide

adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），

產生的吸光峰值的變化（340nm），來定量分析F1F0 ATP酶活性。其反應系統為：

產品內容

YIJI 緩沖液（Reagent A）

YIJI 反應液（Reagent B）

YIJI 陰性液（Reagent C）

YIJI 底物液（Reagent D）

YIJI 專性液（Reagent E）

產品說明書

毫升

毫升

毫升

微升

微升

1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；YIJI 反應液（Reagent B），避免光照，有效保證 6 月

用戶自備

比色皿：用于光譜分析的容器

1

分光光度儀：用于光譜分析

培養箱：用于孵育反應物

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；YIJI 反應液（Reagent B）注

意避光。然后進行下列操作。

一、 測定準備

1． 準備好待測樣品（例如純化線粒體樣品等），置于冰槽里（注意：檢測前溶解線粒體；參見注意事項 4）

2． 設定好分光光度儀（溫度為 30℃）：波長為 340nm，間隔 30 秒，讀數 11 次（共 5 分鐘），并置零

二、 背景對照測定

1． 移取 xx 微升 YIJI 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 YIJI 反應液（Reagent B）

3． 加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent D）

4． 放進 30℃培養箱里孵育 3 分鐘

5． 加入 xx 微升 YIJI 陰性液（Reagent C）

6． 上下傾倒數次，混勻（限定在 3 秒之內）

7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340 波長讀數 0 分鐘 －340 波長讀數 1 分鐘或 5 分鐘

三、 樣品總活性測定

1． 移取 xx 微升 YIJI 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 YIJI 反應液（Reagent B）

3． 加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent D）

4． 放進 30℃培養箱里孵育 3 分鐘

5． 加入 100 微升待測樣品（注意：10 微克總線粒體蛋白；樣品須溶解；參見注意事項 4）

6． 上下傾倒數次，混勻（限定在 3 秒之內）

7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數：340 波長讀數 0 分鐘 －340 波長讀數 1 分鐘或 5 分鐘

四、 樣品非特異活性測定

實驗開始前，移取 100 微升待測樣品（注意：10 微克總線粒體蛋白；樣品須溶解；參見注意事項 4）到 1.5

毫升離心管，加入 xx 微升 YIJI 專性液（Reagent E），混勻后，放進 30℃培養箱里孵育 15 分鐘。然

后置于冰槽里備用

1． 移取 xx 微升 YIJI 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 YIJI 反應液（Reagent B）

3． 加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent D）

4． 放進 30℃培養箱里孵育 3 分鐘

2

5． 加入 120 微升上述預處理的待測樣品

6． 上下傾倒數次，混勻（限定在 3 秒之內）

7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數：340 波長讀數 0 分鐘 －340 波長讀數 1 分鐘或 5 分鐘

五、 計算樣品活性

1）樣品活性（總活性和非特異活性）

【（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X 樣品稀釋倍數】÷【0xx（樣品容量；毫升）Xxx（毫

摩爾吸光系數 X 1 或 5（反應時間，分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾 NADH/分鐘

2）樣品特異活性

樣品總活性測定－樣品非特異活性測定＝樣品特異活性

注意事項

1． 本產品為 21 次操作（10 個樣本），包括 1 次背景對照

2． 操作時，須戴手套

3． 系統操作過程中，背景測定只需 1 次

4． 線粒體樣品檢測前，須溶解；建議超聲處理（20 秒 X 3 循環；50％功率）或凍存融解（－70℃至 37℃）

循環 3 次或使用 YIJI 線粒體溶解試劑盒－GMS10018

5． 建議線粒體懸液使用 0.25 M SUCROSE 和 2 mM EDTA，pH9.0；忌用磷酸緩沖溶液

6． 建議使用線粒體裂解懸液，而不是細胞裂解懸液。如果使用細胞裂解懸液，*須澄清；第二須加 50

微克

7． 加入樣品后 3 秒內即刻光譜測定

8． 反應 1 分鐘后光譜測定值趨于穩定；測定值由高到低變化；測定可以持續 5 分鐘

9． 測定值由高到低變化，即 0 分鐘測定讀數高于 1 分鐘或 5 分鐘測定讀數，表明有酶活性

10．光譜測定后，比色皿須清洗*

11．建議待測樣本線粒體蛋白濃度為 10 微克/100 微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣

本量；注意計算公式的調整（本公司提供 YIJI 線粒體溶解試劑盒 GMS10018 為后續的線粒體蛋

白濃度測定的預處理試劑盒和 YIJI Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒 GMS30030.1）

12．樣品特異活性是指寡霉素敏感的 ATP 合成酶，去除其它干擾因素（例如復合物 I/II/III/IV 等）

13．線粒體呼吸鏈復合物 V 酶活性單位濃度定義：在 30℃溫度下，pH 7.5 條件下，每分鐘內能夠氧化 1 微

摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位

14．本公司提供系列線粒體及其酶類技術產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定檢測準確

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