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上海一基實(shí)業(yè)有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第15年

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如何選擇高內(nèi)涵儀器

時(shí)間:2013-2-25閱讀:1974
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 我們知道,過去十年,圖像獲取和分析的自動(dòng)化為細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展鋪平了道路。一種更加可靠且高產(chǎn)的方法——高內(nèi)涵分析(High Content Analysis,簡稱HCA)應(yīng)運(yùn)而生。

在這十幾年的發(fā)展過程中,市場上出現(xiàn)了很多高內(nèi)涵儀器,這些儀器可以分為三大類:寬場熒光顯微鏡型高內(nèi)涵、共聚焦熒光顯微鏡型高內(nèi)涵和激光掃描型高內(nèi)涵。

各種類型的高內(nèi)涵儀器舉例

 

 

寬場熒光顯微鏡型 共聚焦熒光顯微鏡型 激光掃描型
GE Healthcare IN Cell 2000 GE Healthcare IN Cell 6000 TTP Labtech Acumen eX3
Thermo Fisher Cellomics ArrayScan PerkinElmer Opera Beckman CompuCyte iCys
PerkinElmer Operetta Molecular Devices ImageXpress Ultra    
Molecular Devices ImageXpress Micro        

 

激光掃描型高內(nèi)涵是以激光作為熒光光源,用PMT采集光信號(hào),通過預(yù)設(shè)間距點(diǎn)掃描獲得數(shù)據(jù),沒有成像的過程,速度快是其zui大的優(yōu)勢。分辨率不高,只能提供虛擬圖像是這類儀器的局限性,X軸的分辨率是以預(yù)設(shè)的間隔(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5或5 um)設(shè)定的,而Y軸是用戶自行設(shè)定的,一般在1到10 um。由于不是基于圖像的分析,分析軟件相對簡單,適合于比較成熟簡單的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。所以被很多藥物研發(fā)企業(yè)作為初篩平臺(tái)。

基礎(chǔ)研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相對復(fù)雜,很多時(shí)候需要在亞細(xì)胞水平對細(xì)胞內(nèi)的微細(xì)結(jié)構(gòu)清晰成像,檢測的指標(biāo)也復(fù)雜多樣,需要有非常強(qiáng)大的圖像分析軟件來設(shè)定,所以顯微鏡型的高內(nèi)涵更適合科學(xué)研究的需要,藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)復(fù)雜的篩選實(shí)驗(yàn)也會(huì)考慮使用顯微鏡型高內(nèi)涵儀器。

如何選擇適合自己的高內(nèi)涵儀器,主要考慮三個(gè)方面:

1、成像速度

高內(nèi)涵儀器是在顯微鏡的基礎(chǔ)上搭建的高速顯微成像的平臺(tái),從所得圖像中抽出一張和普通顯微鏡拍攝的圖像沒有區(qū)別,也就是說,寬場熒光顯微鏡型高內(nèi)涵提供的是寬場熒光顯微圖像,共聚焦熒光顯微鏡型高內(nèi)涵提供的是共聚焦質(zhì)量的圖像。

高內(nèi)涵儀器和普通顯微鏡zui本質(zhì)的區(qū)別在于成像速度極大提高,如果每個(gè)孔取一個(gè)視野,雙色熒光,Hoechst染細(xì)胞核,EGFP標(biāo)記細(xì)胞器,硬件自動(dòng)聚焦,GE Healthcare的IN Cell 2000可以在約3分鐘內(nèi)對整塊96孔板成像,在短短幾分鐘內(nèi)得到將近200張照片。IN Cell 2000能夠高速成像是因?yàn)椋?)明亮的光源,和顯微鏡以液體光導(dǎo)纖維相連,光的傳輸效率高,顯著縮短曝光時(shí)間;2)大芯片CCD相機(jī)可選擇,成像視野約是標(biāo)準(zhǔn)芯片相機(jī)成像視野的四倍,大芯片CCD相機(jī)一個(gè)視野就有可能捕捉到足夠的細(xì)胞用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,節(jié)省很多時(shí)間;3)在線細(xì)胞計(jì)數(shù)功能:微孔板各個(gè)孔中細(xì)胞的生長狀態(tài)可能會(huì)不同,在線細(xì)胞計(jì)數(shù)針對不同的孔自動(dòng)調(diào)整拍攝視野數(shù)量,整體縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間;4)自動(dòng)聚焦:是提高成像速度的關(guān)鍵,IN Cell 2000提供基于激光的硬件自動(dòng)聚焦和基于圖像對比度的軟件自動(dòng)聚焦,二者可結(jié)合使用。

需要注意的是,寬場熒光顯微鏡型高內(nèi)涵比普通寬場熒光顯微鏡成像速度快,共聚焦型高內(nèi)涵比共聚焦顯微鏡成像速度快,而共聚焦型高內(nèi)涵未必比普通寬場熒光顯微鏡成像速度快,所以用戶需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要來選擇適合自己的高內(nèi)涵儀器。IN Cell 2000雖然不是共聚焦高內(nèi)涵,但其*的去卷積圖像復(fù)原功能可以顯著提高圖像的對比度和分辨率,提供可以和共聚焦圖像媲美的高質(zhì)量的圖像。

2、圖像質(zhì)量和成像速度之間的平衡

科研用戶既希望成像速度快,又希望圖像質(zhì)量好,可以考慮GE Healthcare的IN Cell 6000。它是以激光為光源的可變光闌線掃描共聚焦高內(nèi)涵儀器,擁有的光學(xué)系統(tǒng),成像*可調(diào):光闌*打開時(shí)成像速度zui快,*共聚焦模式去除背景zui有效,光闌打開的程度在1-3 AU之間可調(diào),可以針對不同的需求調(diào)節(jié)共聚焦程度達(dá)到成像速度和圖像質(zhì)量的優(yōu)化組合。IN Cell 6000感光成像采用550萬像素新一代sCMOS相機(jī),噪音比CCD相機(jī)低五倍,超高靈敏度并縮短曝光時(shí)間,比標(biāo)準(zhǔn)相機(jī)的視野大四倍。

3、圖像分析軟件

科研用戶檢測的指標(biāo)復(fù)雜多樣,除了基本的模塊式分析工具,還需要有更強(qiáng)大的分析軟件允許用戶自主定義分析程序。GE Healthcare的高內(nèi)涵平臺(tái)除了基本的分析工具,還提供IN Cell Developer Toolbox 客戶自定義分析軟件,可以分析各種實(shí)驗(yàn)的圖像結(jié)果。針對特定的實(shí)驗(yàn),用戶使用一系列的圖像分析工具來編寫自己的分析程序,包括:區(qū)分(segmentation)工具,圖像處理工具,自定義測量值,宏子程序等。Developer Toolbox曾獲得2006年*生物圖像分析軟件獎(jiǎng)(美國科學(xué)雜志Scientific Computing頒發(fā))。

Spotfire是一款用于科學(xué)數(shù)據(jù)分析的可視化分析平臺(tái),其zui大的特點(diǎn)是通過多種動(dòng)態(tài)的圖形(點(diǎn)圖、線圖、柱狀圖、餅狀圖、熱圖等)和篩選條件,快速對大量的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理,并可以做出報(bào)告或與他人分享結(jié)果,做出決策。支持多種客戶端界面和Web界面的訪問和顯示。IN Cell 圖像分析軟件內(nèi)嵌和Spotfire DecisionSite Basic軟件連接的圖標(biāo),輕松使用數(shù)據(jù)可視化分析工具。

IN Cell Miner HCM數(shù)據(jù)管理軟件以經(jīng)過驗(yàn)證的 EMC Documentum 軟件為基礎(chǔ),可以方便地注釋、建檔、檢索、存儲(chǔ)高內(nèi)涵圖像和數(shù)據(jù)。研究機(jī)構(gòu)的所有使用者可以分享和比較數(shù)據(jù),zui大限度地挖掘和實(shí)現(xiàn)這些數(shù)據(jù)的價(jià)值。快速制做精美的數(shù)據(jù)圖,用于工作展示、技術(shù)交流和文章發(fā)表。

IN Cell 2000和IN Cell 6000都可以對玻片成像,透射光成像有三種模式可選(明場、相差和微分干涉),可以提供溫度、濕度和CO2用于活細(xì)胞的長時(shí)間觀察,有自動(dòng)移液加樣模塊用于動(dòng)力學(xué)分析。

此外,IN Cell平臺(tái)du有的三種功能為高內(nèi)涵實(shí)驗(yàn)提供更多的幫助:1)預(yù)覽掃描功能:可以在任何放大倍數(shù)下對任意區(qū)域進(jìn)行預(yù)覽掃描,幫助了解樣品概況,確定感興趣的區(qū)域和視野的分布,如果需要,可以對整個(gè)微孔板或者整張蓋玻片進(jìn)行預(yù)覽掃描。2)整孔成像功能:低倍物鏡和大芯片CCD結(jié)合使用時(shí),一張照片就可以快速捕捉整孔細(xì)胞、大面積組織和小生物體的圖像,在用高倍物鏡成像前可以快速確定感興趣區(qū)域的位置,也不會(huì)漏掉偶發(fā)事件。3)手動(dòng)顯微鏡模式:當(dāng)前視野全屏顯示,鼠標(biāo)移動(dòng)到四周可以顯示4組成像工具,分辨率更高,調(diào)整成像參數(shù)后,可以實(shí)時(shí)觀察效果。

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