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大鼠熱休克蛋白70(HSP-70)酶聯免疫分析(ELISA)說明書

時間:2012-4-17閱讀:1820
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大鼠熱休克蛋白70(HSP-70)酶聯免疫分析(ELISA)
試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用 
目的:本試劑盒用于測大鼠血清,血漿及相關液體樣本中熱休克蛋白70(HSP-70)含量。
實驗原理:
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠熱休克蛋白70(HSP-70)水平。用純化的大鼠熱休克蛋白70(HSP-70)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入熱休克蛋白70(HSP-70),再與HRP標記的熱休克蛋白70(HSP-70)抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMBHRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的熱休克蛋白70(HSP-70)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度OD,通過標準曲線計算樣品中大鼠熱休克蛋白70(HSP-70)濃度。
試劑盒組成

試劑盒組成
48孔配置
96孔配置
保存
說明書
1
1
 
封板膜
248
296
 
密封袋
1
1
 
酶標包被板
1×48
1×96
2-8℃保存
標準品:2700ng/L
0.5ml×1瓶
0.5ml×1
2-8℃保存
標準品稀釋液
1.5ml×1
1.5ml×1
2-8℃保存
酶標試劑
3 ml×1
6 ml×1
2-8℃保存
樣品稀釋液
3 ml×1
6 ml×1
2-8℃保存
顯色劑A
3 ml×1
6 ml×1
2-8℃保存
顯色劑B
3 ml×1
6 ml×1
2-8℃保存
終止液
3ml×1
6ml×1
2-8℃保存
濃縮洗滌液
20ml×20×1
20ml×30×1
2-8℃保存

注意事項:
1  試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未用完,板條應裝入密封袋中保存。
2  濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果。
3  各步加樣均應使用加樣器,并經常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內,如標本數量多,推薦使用排槍加樣。
4  請每次測定的同時做標準曲線,做復孔。如標本中待測物質含量過高樣本OD值大于標準品孔*孔的OD,請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數n后再測定,計算時請zui后乘以總稀釋倍數×n×5。
5  封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6  底物請避光保存。
7  嚴格按照說明書的操作進行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
8  所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9  本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異,以英文說明書為準。
樣本處理及要求
1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右2000-3000/。仔細收集上清,保存過程中如出現沉淀,應再次離心。
2. 血漿:應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右2000-3000/。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應該再次離心。
3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右2000-3000/。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20分鐘左右2000-3000/。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時,用PBSPH7.2-7.4稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100/ml左右。通過反復凍融,以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右2000-3000/。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
5. 組織標本:切割標本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBSPH7.4,用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右2000-3000/。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的HRP活性。
操作步驟
1.        標準品的稀釋與加樣:在酶標包被板上設標準品孔10孔,在*、第二孔中分別加標準品100μl,然后在*、第二孔中加標準品稀釋液50μl,混勻;然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl,混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,再各取50μl分別加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul,混勻;混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl,混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl,混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。稀釋后各孔加樣量都為50μl,濃度分別為1800ng/L,1200ng/L,600ng/L300ng/L, 150ng/L。
2.         加樣:分別設空白孔空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl樣品zui終稀釋度為5。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。
3.         溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4.         配液:將3048T20倍濃縮洗滌液用蒸餾水3048T20倍稀釋后備用。
5.         洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。
6.         加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。
7.         溫育:操作同3。
8.         洗滌:操作同5
9.         顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘.
10.     終止:每孔加終止液50μl,終止反應此時藍色立轉黃色。
11.     測定:以空白空調零,450nm波長依序測量各孔的吸光度OD測定應在加終止液后15分鐘以內進行。
計算:
以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,在坐標紙上繪出標準曲線,根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋倍數;或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數,即為樣品的實際濃度。
試劑盒性能:
1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.95以上。
2.批內與批見應分別小于9%11%
檢測范圍:
100ng/L -2000ng/L
保存條件及有效期:
1.試劑盒保存:;2-8。
2.有效期:6個月

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