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熒光免疫技術基本原理

時間:2011-7-26閱讀:4853
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熒光免疫技術是標記免疫技術中發展zui早的一種,始創于20世紀40年代初,由Coons等用異氰酸熒光物質標記抗體,檢查小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。至20世紀50年代末期,Riggs等合成性能較為優良的異硫氰酸熒光黃(fluorescelnisothioeyanante,FITC),并由Marshall等對熒光抗體的標記方法進行了改進,從而使熒光免疫技術逐漸推廣應用。20世紀70年代以來,在傳統熒光抗體技術的基礎上,根據放射免疫和酶免疫測定的原理,發展建立了各種免疫熒光測定法,可用于定量測定體液中抗原或抗體。近年來由于免疫學各個領域的發展,在臨床檢查工作中免疫熒光技術已逐漸突出,如自身抗體的檢測,B細胞、漿細胞的功能探索等皆獲得了廣泛的應用。

免疫熒光檢測法是以熒光物質(也稱為熒光色素或熒光素)作為標記物,標記抗體(或抗原),與相應的抗原(或抗體)反應,根據熒光的存在與否來檢測其是否存在。在實際工作中,用熒光素標記抗體檢查抗原的方法較為常用,所以也稱之為熒光抗體技術(fluorescent antibody technique)。

熒光是由熒光物質的分子吸收外界能量(如光能等),發生電子躍遷,而后以光子的形式釋放出能量,停止能量供給,發光亦立即停止。這個過程中將損失部分能量,因而釋放的光子比激發光的波長長,二者波長之差反映了熒光物質的特征,稱為“stokes改變”。此外,熒光沒有指向性,因而可在任意方向置放檢瀾器,而不一定在激發光的直線上。

熒光素是一種有機染料,用于抗體標記的熒光素具有以下特點:①通常是環狀復合物,與延伸物相連接。單鍵與雙鍵的交替數目越大,被激發的分子穩定性越大,即熒光增強。②分子平面性和硬度越大,熒光傾向越大。③有些分子尤其是螯合物,加入金屬離子可產生強烈熒光。④濃度、溫度、PH值和離子強度均可對分子的熒光效率產生顯著影響。熒光物質的稀釋溶液,可在室溫下使用。熒光可采用常見的、相對較便宜而無害的方法來檢測。此外,結合物在一般儲存條件下性能穩定,可保存使用較長時間。目前用于標記抗體的熒光素主要有異硫氰酸熒光黃(FITC)、四乙基羅丹明(tetraethlrodamine B200,RB200)、四甲基異硫氰酸羅丹明(tet—ramethyl rhodamine isothio-cyanate,TRITC)÷鑭系稀土元素螯合物、藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)及7—氨基—4—甲基香豆素(7—amino-4—methyl couma-rin,AMC>等。其中FITC應用zui廣,羅丹明、PE和AMC常與FITC聯合使用,作為對比染色或雙標記,特別是PE在流式細胞術(flowcytometry,FCM)中較常用。

與紫外可見分光光度法不同,熒光過程是一個主動的過程,其熒光強度依賴于供能的強度,即樣品熒光信號強度與激發信號強度成正比。如果激發信號增強,則熒光信號也增強,因而,采用高強度的光源可大大增強熒光技術的敏感性。這也是熒光檢測法比吸收檢測法更敏感的原因之一。
 

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