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上海一基實(shí)業(yè)有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第15年

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多克隆抗體的制備

時(shí)間:2011-7-22閱讀:1963
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1. 器材:
剪刀(剪兔毛用)一把、彎頭眼科手術(shù)鑷子(游離血管用)一把、直頭眼科手術(shù)剪(剪血管用)一把,手術(shù)刀架,手術(shù)刀片,注射器(1ml、10ml,25ml)附針頭,兔子固定架,滅菌三角燒瓶(200ml)或平皿(直徑18cm)、彎頭止血鉗四把,直頭止血鉗兩把,手術(shù)縫合線,塑料放血管,紗布等。
2. 試劑:
生理鹽水(或PBS),
弗氏*佐劑(Freund’s complete adjuvant, FCA) Sigma F-5881,
弗氏不*佐劑(Freund’s incomplete adjuvant, FIA) Sigma F-5506,
二甲苯,酒精棉,脫脂棉,2% NaN3
3. 兔子的選擇:
兔子的重量應(yīng)在四斤以上,兩耳光滑,明顯可見(jiàn)耳靜、動(dòng)脈,健康。
4. Pre-bleeding:
抗原注射以前需要收集一些正常血清,已備檢測(cè)抗體時(shí)作為陰性對(duì)照。待兔子在新環(huán)境中穩(wěn)定,大概需要四天左右時(shí)間,可以進(jìn)行耳動(dòng)脈取血。取血量約5ml足矣。
免疫用的抗原必須純化,否則影響抗體的質(zhì)量??乖?jīng)FCA或FIA充分乳化后才能注射。將抗原液與佐劑等比例混合后,置于混合器上使之劇烈振蕩使抗原充分乳化,乳化過(guò)程比較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力,但若乳化不充分,會(huì)影響免疫的效果,振蕩后,1000rpm離心一分鐘,如水相和油相不分層即可注射。免疫用FCA,以后都用FIA。
免疫方法可采用背部多點(diǎn)注射法。即于家兔脊柱兩旁選4-6點(diǎn)皮下注射,每點(diǎn)注0.1ml,間隔2周后再于上述部位選不同點(diǎn)注射(不要選擇臨近位點(diǎn),否則潰瘍愈合不好)。每次免疫的抗原量約100μg。免疫次數(shù)在四五次即可,抗原用量大可以減少次數(shù)。
免疫一周后,可以耳動(dòng)脈取血檢測(cè)抗體效價(jià)。因?yàn)槠鸪鯉状蚊庖弋a(chǎn)生的抗體的效價(jià)比較低,頭兩次取血,夠檢測(cè)用即可。在三次免疫后,可以獲得較價(jià)的抗體,每次取血量可以在40ml,不要取太多,否則會(huì)造成兔子貧血。zui后一次取血可以采用頸動(dòng)脈放血,具體操作如下:
a.家兔仰臥于兔架上固定頭部,用紗布固定四肢。頭部略放低以暴露頸部。剃毛并消毒皮膚;
b.沿頸部中線用手術(shù)刀切開(kāi)皮膚約10cm,分離皮下結(jié)締組織,直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突肌(小心操作,如碰到小血管出血,可用止血鉗止血)
c.用直頭止血鉗分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織,暴露出頸總動(dòng)脈后用彎頭眼科鑷使之游離,剝離神經(jīng)和結(jié)締組織;
d.于動(dòng)脈下套入兩根黑絲線,分別置于遠(yuǎn)心及近心端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端的絲線。近心端的動(dòng)脈用血管夾夾住;
e.用小拇指墊在血管下,用尖頭眼科手術(shù)剪在兩根絲線間的動(dòng)脈璧上剪一小口(勿剪斷),插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上,以防放血管滑脫;
f.松開(kāi)止血鉗,使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。
5. 血清的分離:
如果用三角瓶或平皿盛血,將器皿傾斜放置于37oC烘箱2hr,轉(zhuǎn)移到4oC沉淀過(guò)夜,第二天早上用吸管吸取血清。如果用離心管收集,37oC烘箱放置2hr,轉(zhuǎn)移到4oC沉淀過(guò)夜,第二天早上離心,10000RCF,10分鐘。在血清中加入 NaN3 至終濃度0.02%,分裝后-20oC保存。
 

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