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“上海恒遠“文獻:靜電紡絲納米纖維的制備及其蛋白藥物緩釋體系
閱讀：517 發布時間：2019-8-30靜電紡絲納米纖維的制備及其蛋白藥物緩釋體系
顧珊珊，張寒瑩，朱嗣文，吳 飛，金 拓*
(上海交通大學藥學院，上海 200240)
摘要 ：細胞因子蛋白復雜脆弱的構象極易因組織工程支架制備過程中的苛刻條件變性而失活，甚至引起有害的抗體反應。目前有關組織工程支架材料的研究方法尚未實現以天然構象長期緩釋細胞因子蛋白。針對這個難題，本研究運用水相 - 水相冷凍相分離蛋白顆粒制備法，將蛋白藥物血管內皮生長因子 (VEGF165) 保護性載入葡聚糖納米顆粒中，進而將載有蛋白的多糖顆?；鞈矣谧鳛榫忈尰|的聚乳酸 - 羥基乙酸共聚物 (PLGA) 中，通過高壓靜電紡絲，制得長效緩釋VEGF165 的組織工程纖維膜。一系列物理化學表征，包括掃描電鏡 (SEM)、接觸角、強度試驗等，表明上述方法制得了表面形態與機械強度較理想的組織工程纖維。對制備過程中各個階段的蛋白進行回收，并采用 CCK-8 法進行活性檢測證明 VEGF165 的生物活性在多糖顆粒制備階段保持在 97％以上，在終的組織工程纖維膜階段保持在 87％以上，遠大于w/o 型乳液法制備得到的纖維 ( 低于 55％ )。體外試驗證明顆粒復合纖維能抑制蛋白突釋且達到長效緩釋效果，蛋白在初始 5 d 內的釋放總量不到 35％，到 25 d 時釋放量超過 92％。而 w/o 型乳液法制得的纖維在初始 5 d 內的釋放總量超過53.12％，到 25 d 時釋放量為 84.52％。后將纖維膜植入下肢缺血的大鼠體內，進行免疫組化觀察，結果表明顆粒復合PLGA 纖維的再生血管數量明顯高于 w/o 型乳液法制備得到的纖維。
關鍵詞：靜電紡絲；蛋白；緩釋；血管內皮生長因子；血管再生
中圖分類號：R944.9 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8255(2017)09-1325-07
靜電紡絲技術是一種纖維工藝，在高壓電場的作用下，聚合物溶液或熔體進行噴射紡絲，一般所得的納米纖維直徑在 2 nm 到幾微米之間 [1]。靜電紡絲纖維具有類似細胞外基質 (extracellular matrix，ECM) 的三維網狀結構，能較好地模擬天然 ECM，從而提供細胞生長所需的微環境，在組織工程支架制備方面具有*的優勢 [2]。聚乳酸 -羥基乙酸共聚物 (PLGA) 是人工合成的高分子材料，具有良好的機械性，可加工成管狀支架結構，生物相容性好并可*降解，因而成為組織工程材料中研究應用廣的支架材料 [3]。細胞因子蛋白復雜脆弱的構象極易因組織工程支架制備過程中的苛刻條件變性而失活，甚至引起有害的抗體反應。目前有關組織工程支架材料的研究方法尚未實現以天然構象長期緩釋細胞因子蛋白。并且，有關載有生物活性因子的靜電紡絲組織工程支架的制備方法中，普遍存在蛋白藥物的體外突釋嚴重，蛋白藥物容易受到水油界面影響而變性失活，達不到理想的緩釋效果。本課題通過前期發明的無油水界面的水相 - 水相冷凍相分離方法 [4]，根據熱力學分配原理將血管內皮生長因子 (VEGF165) 包裹至葡聚糖 (DEX)納米顆粒中采用靜電紡絲的技術，巧妙地將VEGF165-DEX 納米顆粒與 PLGA 高聚物溶液混合，制得擔載 VEGF165-DEX 納米顆粒的 PLGA 納米纖維膜，并對纖維膜的表觀形態和物理性質進行測定，同時利用 CCK-8 法考察了在纖維和顆粒制備過程中蛋白的活性變化，ELISA 試劑盒檢測體外釋放過程中蛋白的緩釋效果，此外還構建了大鼠下肢缺血模型，考察納米纖維膜的治療效果。
1 儀器與試藥
ss-2534H 型靜電紡絲儀 ( 北京永康樂業科技有限公司)；S-4800 型掃描電鏡 ( 日本 Hitachi 公司 ) ；Alpha1-4型冷凍干燥機 ( 德國 Christ 公司 ) ；MK3 型酶標儀 ( 芬蘭Thermo Labsystem 公司 ) ；Instron5543 型生物力學測試機( 英國特朗公司 ) ；OCA20 型視頻光學接觸角測量儀 ( 德國Dataphysics 公司 ) ；Eclipse 倒置熒光顯微鏡 ( 日本尼康公司)；PM33GT-17 型壓汞儀 ( 美國 Quantachrome 公司 )。PLGA(75/25，MW 66 000 ～ 107 000，美國 Lakeshore Biomaterials 公司 ) ；小鼠血管內皮細胞生長因子 (murine VEGF165，型號 450-32) 和 murine VEGF ELISA kit( 型號900-K99)( 美國 PeproTech 公司 ) ；牛血清白蛋白 (BSA，進口分裝，上海思吉生物有限公司 ) ；0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液 (PBS，pH 7.4，賽默飛世爾生物化學制品有限公司 ) ；CCK-8 試劑盒 ( 日本同仁化學研究所 ) ；DEX(MW 64 000 ～76 000) 和聚乙二醇 6000(PEG 6000) ( 美國 Sigma 公司 ) ；N,N- 二甲基甲酰胺 (DMF)、二氯甲烷和Span-80( 化學純 ) 均購自國藥集團化學試劑有限公司 ；水合氯醛 ( 上海恒遠生物科技有限公司 ) ；多聚甲醛、山羊抗鼠 CD31、RP 標記的兔抗山羊均購自于谷歌生物上海實驗服務中心。人臍靜脈內皮細胞 (HUVECs，中國科學院細胞庫 )。Wistar 大鼠 ( 雄性，170 g，上海杰思捷實驗動物有限公司，合格證編號 2015000511432)。