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G-Rex懸浮細胞培養系統-T細胞

G-Rex懸浮細胞培養系統使用特點：

★ 一次性加入培養基，培養10天，細胞擴增100倍。不需要反復換液和操作細胞

★ 靜置培養，普通的培養箱即可進行

★ 培養瓶與儀器配合，以半自動方式進行細胞回收

★ 生產CAR-T細胞與傳統方法相比表達CD62L和CD25的比例更高，抗腫瘤活性更強

★ 封閉系統，滿足GMP生產要求

G-Rex透氣型培養容器截面說明圖：

系統組成：

1、GatheRex 細胞回收控制器  

2、G-Rex培養容器

訂貨信息：

開放式培養瓶-用于CAR-T細胞優化培養條件及小規模擴增

備注：終獲得的細胞數量與培養面積相關，培養面積相同的培養瓶，終獲得的細胞數量是類似的。

其他應用,已經證實在如下細胞培養中非常有效：

※ 免疫細胞培養（抗原特異性T細胞、EBV-CTL、TL、NK、Treg、HSC、LCL、K562等的研究和臨床生產）

※ 單克隆抗體和重組抗體生產（雜交瘤、CHO、293等)

※ 胰島運輸（多至4000IE/cm²)

初始培養條件推薦：

應用文獻參考：

一、CAR-T(嵌合抗原受體修飾的T細胞）的制備

Molecular Therapy  vol.22 no.3,623-633 mar.2014

Knetics of Tumor Destruction by Chineric Antigen Receptor-modified T Ces(CAR-T細胞破壞腫瘤的動力學研究）

作者：Usanarat Anurathapan1,et al,Juan F Vera1

單位：1Center for Cell and Gene Therapy,Baylor Colege of Medicine,Texas Children's Hospital,and Houston

Methodist Hospital,Houston,Texas,USA.

摘要：

CAR-T細胞作為血液惡性腫瘤和實體腫瘤的治療手段的應用越來越廣泛。然而，在輸入T細胞靶向單一腫瘤相關的抗原產品的壓力下會導致靶抗原調節，造成腫瘤免疫逃逸。為了防止這種現象的發生，我們研究了同時靶向兩種不同的抗原對腫痛細胞的影響。namely mucin 1和prostate stem ce兩種抗原在包括胰腺癌和前列腺癌在內的多種實體腫瘤中表達。單獨使用時，任何一種腫瘤抗原和CAR-T細胞的結合都能殺死腫瘤細胞，但腫瘤的異質性會導致免疫逃逸。我們結合了兩種抗原識別的方法來顯示更好的抗腫瘤效果，但這仍然不足以達到*緩解（CR）。為了了解腫瘤逃逸的機制，我們研究了T細胞殺傷的動力學，發現腫瘤破壞的程度不僅取決于靶抗原的存在，還取決于靶抗原表達的強度。而這一特征可以通過epigenetic modulator上調靶標的表達，和增強CAR-T細胞的殺傷力來改變。

簡要實驗方法：

T細胞的病毒轉導：將表達CAR-MUC2或CAR-PSCA的逆轉錄病毒在24孔板中感染。CAR-T細胞的快速擴增使用G-REX 100M培養瓶，直接加入1L含50U/ml IL-2的培養基進行擴增。

實驗結果：

針對不同靶點的CAR-T細胞治療效果：由于腫瘤存在異質性，針對單一靶點會產生腫瘤免疫逃逸。而結合了兩種抗原識別的CAR-T細胞，擁有更強的抗腫瘤活性

摘要：

An Opimzed frocess of Generating CAR-T Cells for Cinical Applications

Pradip Bajgain1,et al,Juan F.Vera 1.

使用G-Rax100M擴端CAR-PSCA T細胞，初給細胞數25E+6，一次性加入1L培養基，每周加入3次IL2，終得到細胞數2963.8±195.2E+6。

使用G-Rex生產的CAR-T細胞與傳統方法培養20天相比表達CD62L和CD25的比例更高，抗腫瘤活性更強。

二、TCR-T細胞的制備

JTransl Med (2018) 16:13

Erhanced ctinical-scale manutactuing of TCR rnsduced T-cels using closed cuture systen modues(使用封閉式系統加速臨床級別TCR-T細胞的生產)

作者：Jianjan Jin1,et al,David F.Stroncek1 and Steven L.Highfl

單位：1Center or Celular Engineering. Departnment of Tanstuslon Medcne, Cintcal Center,Natonal hstutes of

Health,USA

摘要：

背景：用于表達特異性T細胞受體（TCR）的T細胞的基因工程已經成為治療各種惡性腫瘤的新策略。由于缺乏能夠擴增足夠數量的T細胞用于臨床的封閉培養系統，使得這些類型的療法的廣泛使用受到一定程度的限制。在這里，我們評估了一個強大的臨床級制造TCR基因工程工細胞的過程。

方法：對人乳頭瘤病毒E6和E7的TCR進行了獨立測試。21天的過程分為一個轉導期（7天）和一個快速擴增期（14天）。用兩份健康的供體樣本和四份上皮癌患者的樣本對這一過程進行了評估。

結果：該過程使活的有核細胞增加了2000倍，并且轉導效率高（64%-92%）。在培養結束時，功能測定表明這些細胞有效而特異的殺傷腫瘤組胞的能力，并分泌大量的干擾素和腫瘤壞死因子。培養的兩個階段采用了封閉或半封閉的模塊，包括一階段的自動密度梯度分離和細胞培養袋以及第二階段的封閉的G-Rex培養裝置和洗滌/濃縮系統。

結論：使用模塊化系統和半自動設備，可以大規模的制造高活性的臨床級TCR轉導的T細胞。該過程目前正在NIH臨床中心和一些進行中的臨床試驗中使用，并可用于其他使用封閉系統擴大和優化其生產過程的細胞治療制造場所。

生產流程圖。

此圖概括了E6 TCR-和E7 TCR-特異性T細胞的制造方案。一階段（左）概述了培養物的轉導階段，并延續至第7天。在培養階段結束時，細胞可以冷凍保存，或者進入第二階段（培養物的快速擴增階段）。在這一階段，TCR轉導的T細胞與來自三個不同供體的同種異體飼養細胞混合，并在封閉的G-REX500培養裝置中擴增14天。

三、TIL(腫瘤浸潤淋巴細胞）的制備

JImmunother.2012 April:35(3):283-292

Simplified Method ol tho Growth of Human Tumor Infilrating Lymphootes (TIL)in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Pationt Treatment(使用透氣型培養瓶將TIL細胞培養至病人治療所需細胞數的筒單方法)

作者：Jianjian Jin1,et al,Steven A. Rosonberg2

單位:1Cell Processing Section,Department of Transfuslon Medicine,Clinical Center,National Institutes of

Heatth Bothesda,Maryland,USA 2Surgery Branch,Natonal Cancer Instituto,National Institutos of Heath,Bothesda,

Maryland,USA 3Wlson Wolf Manutacturing.New Bnghton,MN,USA

摘要：使用自體腫瘤浸潤腫瘤T淋巴細胞治療惡性黑色素瘤的臨床效果很好。但TIL細胞的制備過程非常困難。在此，我們使用一種透氣型培養瓶建立了快速擴增TIL細胞的簡單方法。首先在G-Rex10中培養從腫瘤消化液和腫瘤碎片得到的TIL細胞，接下來使用能容納500ml培養基的G-REX100進行快速的擴增培養。來源于14位患者中13個的腫瘤消化液和全部11個腫痛碎片的TIL細胞，在G-Rex10中成功完成了初始生長。然后將得到的TIL細胞接種5×10⁶TIL到G-Rex100中，生長7天后分至3個G-Rex100。經過2次快速擴增，細胞可擴增成8-10×10⁹，先將的TIL接種燒瓶中，為了獲得用于患者治療的30-60×10⁹組胞，我們用接種6只G-Rex100（5x10⁶細胞/瓶），擴增成18個G-Rex100。用G-REX大規模培養TIL細胞，快速擴增大約需要9-10升培養基，大約只有其做方法的1/3-1/4。

流程簡介：

TIL的初始培養：將病人的腫瘤組織切成小塊(1-8mm)，加入酶消化(RPMI 1640.2mM Glutmax.10 u g/mL慶大霉素30 units/mL. Dnase和1.0 mg/mL膠原酶），同時使用機械法進行組織分離。組織塊加入消化液后立即機械分離1分鐘、然后放入孵箱孵育30分鐘，再次機械分離1分鐘。再放入孵箱繼續孵育30分鐘，然后進行第三次機械分離。如果第三次分離之后仍有大塊組織存在，可以再進行1-2輪處理。如果終產物中有大量紅細胞或死細跑，可進行密度梯度離心去除。

分離得到的細胞取10-40×10⁶細胞加入40ml培養基，加入G-REX10培養瓶中進行培養。24孔板與G-REX10都放入孵箱，第2-3天換半液，培養至第五天。然后組胞轉至G-REX100。

TIL的快速擴端培養:

實驗結論：總體來說，與24孔板加普通培養瓶和培養袋的流程相比，用透氣型G-REX培養瓶進行TIL的起始培養與后續快速擴增，需要的耗材更少，需要的培養基更少，需要的培養箱空間更少，需要的操作更少。使用G-REX培養瓶，將使大多數實驗室能大批量培養TIL用于臨床治療。

四、CTL(抗原特異性T淋巴細胞）的制備過程

JImmunother.2010 April:33(3):305-315

Accelerated production of antigen-specic T-cells for pre-clinical and clinical applications using Gas-

permeable Rapid Expansion culture ware(G-Rex)(使用G-REX加速抗原特異性T細胞的生產過程以進行臨床前和臨床應用）

作者：Juan F.Vera,et. al.

單位：Center for Cell and Gene Therapy,Departments of Pediatrics,Immunology,Medicine,Virology,Baylor

College of Medicine,The Methodist Hospital and Texas Children's Hospital

摘要：用于過繼免疫治療的抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL）的大量制備，由于受到其預期功能和特異性的限制是非常復雜和花費時間的。其培養的條件非?？量?，有時只能在2cm²的孔中實現培養，但會受到氣體交換、營養物質和廢物積累的限制。為克服這些困難而采用的一些生物反應器復雜而昂貴，并且有時細跑生長的效果不佳。本研究發現抗原特異性CTL在經過刺激后會經歷7-10次分裂。但是預期的CTL擴增倍數只有在培養的一周能達到。通過重復一周時的培養條件，我們能夠讓CTL細胞擴增至預期的水平，這一水平能維持數周而不影響細胞表型和功能。但是所需24孔板的數量非常多，并且需要頻繁的更換培養基，從而增加了實驗的復雜性和生產成本。因此，本研究評估了一種新型的適氣型培養裝置（G-REX)，該裝置通過底部的硅膠膜通透空氣，使得細胞生長不受培養基深度的限制。

實驗方法及結果：

實驗結論：G-Rex系統能夠有效的支持CTL細胞的擴增，終可以增加高達20倍的產量，但所需的技術人員的時間卻大大下降。重要的是，在此裝置中的細胞擴增不是因為細胞分裂的多，而是因為細胞死的少。因此這一裝置能增加T細胞產量，降低CTL生產時的復雜性和費用?？梢允辜毎煼ǜ捉邮?。

五、NK（自然殺傷細胞）的制備

Cytotherapy,2012;14:1131-1143

Large-scale ex viwo expansion and characterization of natural killer cells- for clinical applications(大批量體外擴增和鑒定NK細胞用于臨床治療)

作者：Natalia Lapteva1,et al.

單位：1Center for Cell and Gene Therapy.The Methodist Hospital,Texas Children's Hospital,Houston,TX and

2Department of Pediatrics,Baylor Colege of Medicine,Houston,Texas,USA,3National University of Singapore,

Singapore,and 4University of Arkansas Medical Center,Litle Rock,Arkansas,USA

摘要：

背景及目的：純化和大批量擴增臨床級別細胞的新方法使以NK細胞為基礎的免疫療法又引起人們的興趣。

方法：我們成功的將之前發表的，使用表達1L-15和4-1BBL的K562細胞擴增NK細胞的方法，用新型的透氣型靜止培養瓶（G-REX）進行了改進。

結果：使用這一新的系統，我們從15×10⁷個CD3-CD56+NK細胞開始，在8-10天時間內，制備了高達19×10⁹具備功能的NK細胞。G-REX與傳統透氣袋相比，擴增NK細胞的倍數更高，培養過程中不需換液或操作細胞。我們也發現在NK細胞上清刺激的情況下，K562-mb15-41BBL細胞能上調了細胞表面HLA1|型抗原的表達，這一細胞能刺激NK細胞中自體反應性CD8+T細胞。但是這些CD3+T經胞使用CliniMACS系統成功去除。我們優化的NK細胞凍存方法使NK細胞凍存12個月后依然有活力和功能。

結論：我們成功建立了使用透氣型G-REX靜止培養并大量擴增NK細胞的方法，符合GMP標準。這一方法能用于制備NK細胞進行癌癥免疫治療。

優點：

※ 同樣培養時間，細胞增殖更快

※ 每個G-REX一次性加入400ml培養基，培養過程中無需換液，無需再續培養基

※ 操作少，減少污染的風險

※ 靜置培養，在普通的培養箱放置即可

※ 細胞回收時可以先棄去大部分培養基再離心（1000ml vs.8000ml），操作更簡單。