成人做爰免费视频免费看_成人a级高清视频在线观看,成人a大片在线观看,成人a大片高清在线观看,成人av在线播放,一a一级片,一级黄 中国色 片,一级黄 色蝶 片,一级黄色 片生活片

疫苗DNA殘留對人體的潛在危害

對所使用的疫苗，我們zui關心的是疫苗的效果和其安全性。現(xiàn)在很多疫苗是細胞培養(yǎng)疫苗，比如重組（CHO細胞）乙肝疫苗，Vero細胞狂犬病疫苗等大多數(shù)疫苗都是用細胞培養(yǎng)的方法生產(chǎn)，而對疫苗的純化是關鍵問題，我們要盡可能的去除宿主細胞DNA和宿主蛋白。假若宿主細胞的DNA和蛋白同疫苗一起注入人體將會產(chǎn)生不可預料的后果。就以疫苗DNA殘留為例，疫苗DNA殘留可能造成插入突變﹑導致抑癌基因失活﹑癌基因被激活等，zui終造成疫苗使用者致癌。

疫苗DNA殘留的相關法規(guī)

由于有如此潛在的危險性，所以許多機構對疫苗DNA殘留制定了相關標準，1986年世界衛(wèi)生組織規(guī)定用細胞系生產(chǎn)的疫苗DNA殘留不能超過100 pg /支 ，而在1998年世界衛(wèi)生組織認為細胞系生產(chǎn)的疫苗DNA殘留不能超過10 ng /支，而在1997年美國藥品食品衛(wèi)生*規(guī)定在美國使用的細胞系疫苗DNA殘留不能超過10 pg /支，中國規(guī)定的細胞系疫苗DNA殘留不能超過100 pg /支。

所以在疫苗生產(chǎn)中要隨時對DNA殘留進行檢測，以便知道每個過程除掉DNA殘留的能力。在每一批產(chǎn)品中我們必須檢測DNA殘留，所以我們必須運用敏感且行之有效的對DNA殘留定量的檢測方法。通常規(guī)定每支疫苗DNA殘留不能超過100 pg，也就大約等同于17個甚至更少CHO細胞基因組DNA的含量，對如此微量的DNA殘留進行檢測，所用的技術方法就必須相當敏感和穩(wěn)定，現(xiàn)在對DNA殘留定量的方法主要有以下三種：
1、分子雜交技術檢測DNA殘留
2、基于DNA結合蛋白的方法（Threshold® immunoassay）檢測DNA殘留
3、實時定量PCR法檢測DNA殘留

分子雜交技術檢測DNA殘留的原理和方法

分子雜交分析的基本原理是基于DNA探針檢測變性而且固定在纖維素膜上的宿主細胞DNA。這些探針可以不依賴宿主細胞DNA來制備，例如用隨機引物制備探針。探針上標記酶﹑生物素﹑放射性同位素﹑地高辛（Dig）等。由于地高辛標記核酸探針，操作方便、靈敏度高，已標記的探針在4℃貯存可達兩年之久，方便隨時應用，所以現(xiàn)在常采用地高辛標記核酸探針，用光標記法將光敏Dig標記到探針上，制成光敏-Dig-核酸探針，再與固定在膜上的靶核酸進行靶DNA分子雜交，使之與抗Dig-堿性磷酸酶結合，zui后可用不同的檢測方式進行檢測，發(fā)光檢測和顯色檢測均可，靈敏度可達10pg以下（表 1  三種DNA殘留檢測方法的比較）。

基于DNA結合蛋白的方法（Threshold® Immunoassay）檢測DNA殘留的原理和方法

Threshold® Immunoassay分析系統(tǒng)是基于兩種DNA序列非特異性蛋白，單鏈DNA（ssDNA）結合蛋白（SSB）和抗ssDNA 的單抗。檢測的基本過程是當生物素—DNA單鏈結合蛋白和尿素酶—抗ssDNA 的單抗與變性的宿主細胞DNA結合zui終形成復合物，通過親合素將此復合物連接到生物素—纖維素膜，在通過洗滌所有非特異性的被洗脫掉，zui后放于有尿素溶液的讀數(shù)儀，尿素酶催化尿素分解成NH3和CO2 導致PH值發(fā)生變化，讀數(shù)儀根據(jù)PH值的變化換算成DNA的量，從而達到檢測DNA殘留含量的目的。

實時定量PCR法檢測DNA殘留的原理和方法

熒光定量PCR是基于PCR擴增時，在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，產(chǎn)物的增加可以通過熒光信號指示，通過實時監(jiān)控PCR體系中的熒光信號，對樣本中初始模板進行定量分析。定量PCR可實時檢測產(chǎn)物量，通過加入已知濃度的標準樣品繪制標準曲線，然后根據(jù)待測樣品在標準曲線中的位置推算初始模板的濃度，從而達到檢測DNA殘留含量的目的。

三種檢測DNA殘留方法的比較

3種方法用來檢測疫苗DNA殘留都要對樣品進行相應的處理，這對zui終的結果的準確性至關重要。而雜交相對對樣品DNA的損失小，而用Q-PCR需要提取樣品的DNA，損失較大。在我們選擇那種方法時我們要考慮它的穩(wěn)定性，敏感性，成本等以至找到*的性價比的方法（表 1），從表1 我們不難發(fā)現(xiàn)使用分子雜交的方法是一種比較可行經(jīng)濟實用的方法，目前國內也主要是用此方法。

表 1  三種DNA殘留檢測方法的比較