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上海起發(fā)GMP級別轉(zhuǎn)染試劑說明書
BIOHUB Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)
訂購信息
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
78EF10003-5Ml 78EF10003-1L | BIOHUB Polyethyleneimine PEI PRO(GMP) | 5Ml 1L |
儲存溫度：2-4℃保存?年。（避免冷凍）
產(chǎn)品描述
BIOHUB Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)是GMP級別轉(zhuǎn)染試劑，本制品利BIOHUB公司生產(chǎn)的線性陽離子聚合物,按照符合GMP認證管理體系下，采用藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn)，所用起始材料及所需化學品和配制過程均在無菌環(huán)境中操作進行，以確保制造過程中每個步驟的特性、效力、純度和安全性的一致性 。并嚴格控制重金屬殘留、細菌內(nèi)毒素殘留等，生產(chǎn)工藝符合 GMP 規(guī)范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規(guī)程，保障生產(chǎn)過程及所有原輔料可追溯。
1.PH值檢測通過中國藥典 2020版第四部 pH 值測定法(通則 0631)
2.檢測遵循《人用基因治療總論-中國藥典 2020》國家藥典委。
3.檢測遵循USP Chapter <1043>, Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered 4.Products 用于細胞治療，基因治療和組織工程產(chǎn)品中的輔料。
5.細菌內(nèi)毒素檢測符合中國藥典2015版四部通則（1143）方法2光度測試法（動態(tài)濁度法）
6.重金屬殘留檢測符合國藥典 2020版第四部重金屬檢查法(通則 0821)
7.支原體檢測 使用支原體檢測試劑盒
產(chǎn)品特點
BIOHUB-PRO GMP在 HEK293和CHO大多數(shù)表達系統(tǒng)中,BIOHUB-PRO GMP 都能提供穩(wěn)定的高表 達（96 孔板至 100L 生物反應器）。現(xiàn)在每年有更多的研究人員和公司選擇使用 BIOHUB-PRO GMP 進行細胞轉(zhuǎn)染.。
1.GMP級別定制監(jiān)管，支持并滿足合規(guī)要求。
2.不含動物源性成分。
3.嚴格遵循以下規(guī)范生產(chǎn) 1. ISO 9001:2015, certified facility。
4.嚴格按照《GMP 附錄-細胞治療產(chǎn)品》國家藥品監(jiān)督管理局。
5.從工藝開發(fā)到臨床試驗和商業(yè)化的無縫過渡生產(chǎn)細胞系（HEK-293 和衍生物、VERO 等的最高病毒產(chǎn)量。
6.超高的性價比
操作方法參考
一、貼壁細胞轉(zhuǎn)染 以 6 孔板轉(zhuǎn)染 293T 細胞為例：
（一）轉(zhuǎn)染前準備
1) 轉(zhuǎn)染前一天：用膠原酶 （WORTHINGTONG 公司 LS004196)消 化細胞并計數(shù)（不建議用胰酶）。 按照每孔2×10 6的細胞量接種293T至6孔板(每孔加入2ml新鮮DMEM:F12+5%FBS *培養(yǎng)基和 1ml 的細胞懸液)置于 37°C,5%CO2培養(yǎng)箱培24h。
2) 24h 后,移除之前培養(yǎng)基，每孔加入 2ml 新鮮的 DMEM:F12+5%FBS。
注意：確保 293T 細胞生長狀態(tài)良好傳代 不超過15代。
（二）轉(zhuǎn)染過程
3) 第一天：顯微鏡下檢查細胞匯合度，當細胞達到 70%到 80%的匯合度時，開始準備轉(zhuǎn)染。
4) 對于每孔細胞，用 100µl 無血清培養(yǎng)基（如 OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基）稀釋 DNA 使 DNA 終濃 度為 1ug/ml（DNA/總培養(yǎng)體積）。
5) 對于每孔細胞，用100μ無血清培養(yǎng)基（如 OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基）稀釋適當比例的適量 BIOHUB-PRO GMP 。DNA:BIOHUB-PRO GMP 的比例要依據(jù)自己實驗摸索最適比例。
6) 將稀釋的 BIOHUB-PRO GMP轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋的質(zhì)粒中（總體積 200µL）輕輕混勻， 室溫孵育30分鐘。
7) 小心地將 BIOHUB-PRO GMP復合物滴加到細胞培養(yǎng)板每個孔中，輕輕搖動培養(yǎng)板混勻。注 意加入混合液時輕輕沿著孔板邊緣滴入，而不是在細胞的頂部以免破壞細胞的粘附性。
8) 將培養(yǎng)板放入 37°C，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)中培養(yǎng) 24h。
（三）觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果 9) 第二天：在熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染效率，通常超過 80%的 293T 細胞在轉(zhuǎn)染后的 24h 可以觀察到綠色熒光。 小貼士 :建議進行不同基因轉(zhuǎn)染時應對 BIOHUB-PRO GMP 和 DNA 的比例進行優(yōu)化，以達到最適比例， 通常篩選范圍在 1:1 到 1:3 之間。如果之前用過進口品牌的 PEI，用BIOHUB-PRO GMP時應適當 降低使用濃度。
通常情況下，分別準備BIOHUB-PRO GMP 和DNA轉(zhuǎn)染溶液時其體積一般是轉(zhuǎn)染前每孔細胞培 養(yǎng)液體積總量的 1/10-1/20，如細胞培養(yǎng)液體積為 3ml，則稀釋BIOHUB-PRO GMPI及 DNA 的體積為150ul。質(zhì)粒 DNA 的濃度通常為 1ug/ml（DNA 質(zhì)量/細胞培養(yǎng)總體積）[1][4]。 不同質(zhì)粒種類以及大小會影響轉(zhuǎn)染效率，如較大片段插入質(zhì)?？赡苻D(zhuǎn)染效率低，可根據(jù) 實際實驗需要調(diào)整，如適當增加轉(zhuǎn)染質(zhì)?？偭康取??HEK293 GnTI 細胞重懸浮可用槍頭或移液管反復吹打，但 CHO-S 細胞的粘附性比較強 重懸浮時需要借助細胞刮刀。 一般建議用膠原酶消化細胞，如果表達的是膜蛋白，胰酶消化細胞可能會降低蛋白表達， 建議用膠原酶消化細胞，我們推薦(LS004196WORTHINGTONG)的膠原酶。 對于貼壁性低的細胞系，可用明膠或鼠尾膠鋪板，增加細胞與培養(yǎng)皿之間的粘附性。 一旦確定了細胞類型、培養(yǎng)基和78BioPEI GMP與 DNA 的最佳比例，就可以在轉(zhuǎn)染后 24 至 96 小時內(nèi)多次觀察轉(zhuǎn)染效率，以優(yōu)化最大表達量時間點。
二、懸浮細胞轉(zhuǎn)染 離心對數(shù)期生長的細胞用新鮮的培養(yǎng)基重懸浮使細胞密度達到 1×10 6cells/mL 小規(guī)模轉(zhuǎn) 染時，如需大規(guī)模轉(zhuǎn)染細胞密度要到達 2-3×10 6cellsml/mL，可參考文獻[4]。以 293F 細胞 于 100mL 培養(yǎng)瓶（溶液體積占瓶體積的 1/5）操作體系舉例如下：
（一）轉(zhuǎn)染前準備
1) HEK293F 細胞傳代接種于 20mL 懸浮細胞生長培養(yǎng)基中(36.5℃，120rpm，5%CO2 )的條 件下培養(yǎng)。當細胞密度到 1X10 6cells/mL，然后旋緊瓶口放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)，2~4 小時 后可以進行轉(zhuǎn)染。
（二）轉(zhuǎn)染過程
2) 用 1mlOptiPRO™SFM(無血清培養(yǎng)基)稀釋適量的 DNA，使 DNA 終濃度為 1ug/ml（DNA/總 培養(yǎng)體積）。混勻并靜置 5min。
3) 用1mlOptiPRO™SFM(無血清培養(yǎng)基)稀釋適當比例的BIOHUB-PRO GMP，混勻并靜置 10min。
（78BioPEI：DNA 參考比例范圍，可參考上述貼壁細胞BIOHUB-PRO GMP和 DNA 優(yōu)化方案優(yōu)化）。
4) 將BIOHUB-PRO GMP轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋的質(zhì)粒中輕輕混勻，室溫孵育 30 分鐘。
5) 將BIOHUB-PRO GMP轉(zhuǎn)染復合物逐滴加入到細胞培養(yǎng)液中，搖勻后旋緊瓶口放回搖床 （36.5℃，5%CO2,120rpm）。
6) 基因表達可在 24-72 小時后檢測，具體時間取決于細胞系和轉(zhuǎn)基因.
小貼士
在懸浮培養(yǎng)中，單個細胞的轉(zhuǎn)染效率要高于聚集在一起的細胞，需要優(yōu)化適合單細胞的 生長條件。 方形瓶應經(jīng)過兩個連續(xù)的干燥循環(huán)高壓滅菌（每個 45 分鐘，干燥 15 分鐘） 蓋子應盡可能松，不得脫落。應該讓它們冷卻擰緊蓋子前，將其*放入層流罩中。如果瓶子向內(nèi)塌陷，細胞將無法正常生長。 如果要獲得更多的蛋白產(chǎn)量，有參考文獻表明轉(zhuǎn)染后 24 小時，可以適當稀釋細胞，稀釋比例參考范圍（1:2—1:5）之間，可以增加蛋白產(chǎn)量，稀釋效應與最佳稀釋比率應根 據(jù)經(jīng)驗確定, 可以把 DNA 和BIOHUB-PRO GMP 轉(zhuǎn)染試劑直接加入到細胞懸液中進行轉(zhuǎn)染，但必須經(jīng)過上述 特定流程的 DNA 和轉(zhuǎn)染試劑的比例和用量的相應優(yōu)化。
注意事項
1.不同質(zhì)粒種類以及大小會影響轉(zhuǎn)染效率，可如較大片段插入質(zhì)?？赡苻D(zhuǎn)染效率低，可根據(jù)實際實驗需要調(diào)整，如適當增加轉(zhuǎn)染質(zhì)?？偭康?。
2.細胞狀態(tài)及代數(shù)會較大程度影響轉(zhuǎn)染。剛復蘇細胞需傳代2-3次以上，待細胞生長穩(wěn)定后做轉(zhuǎn)染實驗。為保證實驗穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)染細胞盡量選擇20代以內(nèi)進行實驗。
3.對于貼壁性低的細胞系，可用明膠或鼠尾膠鋪板，增加細胞與培養(yǎng)皿之間的粘附性。
初次使用應優(yōu)化DNA濃度和 BIOHUB-PRO GMP試劑量以得到最大的轉(zhuǎn)染效率。
4.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
