聯(lián)系電話
上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司
中級會員·16年
- 聯(lián)系人：
- 楊經(jīng)理
- 電話：
- 021-50724187 021-50724961
- 手機(jī)：
- 15921799099
- 傳真：
- 021-50724961
- 地址：
- 上海浦東川沙鎮(zhèn)川沙路6619號上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司
- 個性化：
- www.qfbio.com
- 網(wǎng)址：
- www.qfbio.com
掃一掃訪問手機(jī)商鋪
 提 供 商 |
上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司 |  資料大小 |
29.9KB |
|---|---|---|---|
 資料類型 |
WORD 文檔 |  資料圖片 |
【點(diǎn)擊查看】 |
 下載次數(shù) |
260次 |  瀏覽次數(shù) |
4215次 |
訂購信息
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 保存 | 價(jià)格(元) |
EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染液 | C4058L1080 | 1mL | 4℃ | 200 |
EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染液 | C4058L1082 | 50mL | 4℃ | 1800 |
EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染液 | C4058L1084 | 500mL | 4℃ | 3500 |
產(chǎn)品描述：
細(xì)胞轉(zhuǎn)染液（核心成分為線性聚乙烯亞胺，也稱作LPEI），是新一代的轉(zhuǎn)染試劑，帶正電的聚合物與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán) 形成帶正電的復(fù)合物后與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用，并通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。除了具有陽離子脂質(zhì)體（如：Lipo2000,3000）的轉(zhuǎn)染效率高，操作簡單，適用范圍廣，重復(fù)性好等特點(diǎn)外，還具有在體內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性低等特點(diǎn)。
EZ Trans是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機(jī)大分子，每相隔二個碳個原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子，使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿”體。其轉(zhuǎn)染性能好于樹枝狀聚合物，而且它的細(xì)胞毒性低。
使用方法：
瞬時轉(zhuǎn)染方法
1. 接種細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天，用膠原酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)（不建議用胰酶）。調(diào)整細(xì)胞濃度，將細(xì)胞鋪入細(xì)胞培養(yǎng)的器皿，每個孔置入的細(xì)胞量應(yīng)能使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞匯合度達(dá)到 70~80%。
2. 準(zhǔn)備 DNA-PEI 復(fù)合物： DNA、EZ Trans 試劑和稀釋劑在進(jìn)行以下步驟前需先使其升至室溫。依據(jù)下表所示，用 Opti-MEM ITM（Invitrogen）或其他適合的無蛋白培養(yǎng)基稀釋適量 DNA。用同樣的培養(yǎng)基稀釋EZ Trans 試劑。每 1 μg DNA 需用2-5 μL EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑。一邊輕輕渦旋裝有 DNA 溶液的試管，一邊將稀釋的EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑滴加至試管中（注意：請勿顛倒添加順序）。充分混勻后，室溫靜置 10~25 min 以形成DNA-PEI復(fù)合物。當(dāng)溶液體積較大時，請用圓底聚丙烯管，例如 Falcon 5 mL /14 mL 離心管。
3. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞：直接向每個孔中加入 DNA-PEI復(fù)合物并輕輕渦旋培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿。在無血清條件下轉(zhuǎn)染時，去除生長培養(yǎng)基，替換成無血清培養(yǎng)基，然后滴DNA-PEI復(fù)合物。轉(zhuǎn)染 3 h 后，添加1/2體積的包含 30%血清的生長培養(yǎng)基。
4. 孵育細(xì)胞和分析結(jié)果：在 CO2培養(yǎng)箱中 37℃下孵育細(xì)胞至可以分析檢測。轉(zhuǎn)染后zui快 7h 即可檢測到轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)。請自行確定檢測時間。?
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法
1. 接種細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天，用胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度，將細(xì)胞鋪入細(xì)胞培養(yǎng)的器皿，總體積如表 1 所示，每個孔置入的細(xì)胞量應(yīng)能使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞匯合度達(dá)到 70~80%。
2. 準(zhǔn)備 DNA-PEI 復(fù)合物： DNA、PEI 試劑和稀釋劑在進(jìn)行以下步驟前需先使其升至室溫。依據(jù)表 1 所示，用 Opti-MEM ITM（Invitrogen）或其他適合的無蛋白培養(yǎng)基稀釋適量 DNA。用同樣的培養(yǎng)基稀釋PEI 試劑。每 1 μg DNA 需用2-5 μL EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑。一邊輕輕渦旋裝有 DNA 溶液的試管，一邊將稀釋的EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑滴加至試管中（注意：請勿顛倒添加順序）。充分混勻后，室溫靜置 10~25 min 以形成 DNA-PEI復(fù)合物。當(dāng)溶液體積較大時，請用圓底聚丙烯管，例如 Falcon 5 mL /14 mL 離心管。
3. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞：直接向每個孔中加入 DNA-PEI復(fù)合物并輕輕渦旋培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿。在無血清條件下轉(zhuǎn)染時，去除生長培養(yǎng)基，替換成無血清培養(yǎng)基，然后滴DNA-PEI復(fù)合物。轉(zhuǎn)染 3 h 后，添加½體積的包含 30%血清的生長培養(yǎng)基。
4. 孵育細(xì)胞和分析結(jié)果：在 CO2培養(yǎng)箱中 37℃下孵育細(xì)胞至可以分析檢測。轉(zhuǎn)染后zui快 7h 即可檢測到轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)。
5.轉(zhuǎn)染 24 h 后，將細(xì)胞傳代至新鮮的生長培養(yǎng)基中（將細(xì)胞稀釋 10 倍以上），在 CO2培養(yǎng)箱中 37℃孵育隔天。第二天加入與轉(zhuǎn)染抗性基因相匹配的篩選藥物。約 1~2 周可篩選到耐藥性克隆，在這期間需經(jīng)常更換含篩選藥物的生長培養(yǎng)基。
運(yùn)輸與保存方法：
常溫運(yùn)輸，4℃保存，保質(zhì)期12個月。
使用注意事項(xiàng):
質(zhì)粒質(zhì)量：請務(wù)必使用高質(zhì)量轉(zhuǎn)染級無內(nèi)毒素質(zhì)粒。通過 260 nm 光吸收測定 DNA 濃度，260 nm / 280 nm 比值確定 DNA 純度（比值應(yīng)該在 1.8~2.0 的范圍之內(nèi)）。如有可能，請通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒的完整性。
細(xì)胞條件：使用適當(dāng)保存和經(jīng)常傳代的健康細(xì)胞。確保培養(yǎng)基沒有被細(xì)菌、真菌或支原體污染。如果細(xì)胞是近期復(fù)蘇的液氮凍存細(xì)胞，請?jiān)谵D(zhuǎn)染前至少傳代兩次。建議使用GIBCO或者李記生物的胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞。?
特別提醒:
1. 對于某些類型的細(xì)胞如 HEK-293、HEK293T、NIH/3T3 和 COS 細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前兩天鋪板可顯著提高轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)水平。如果選擇轉(zhuǎn)染前兩天鋪板，可適當(dāng)降低鋪板密度，以確保轉(zhuǎn)染時細(xì)胞的匯合度仍為 70~80%。
2. 對于接觸抑制敏感的細(xì)胞，可適當(dāng)降低鋪板密度。
3. 即使在有蛋白（如 10%的血清）存在的情況下，DNA-PEI復(fù)合物仍能轉(zhuǎn)染細(xì)胞，但是 DNA-PEI復(fù)合物必須在無蛋白存在的條件下形成。
4. 對大多數(shù)細(xì)胞來而言，每 1 μg DNA 使用 3.0 μLEndoFectinTM 試劑都能獲得較高轉(zhuǎn)染效率。使用者也可嘗試每 1 μg DNA 使用 1~4 μL 體積線性PEI轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行優(yōu)化。
附：幾種細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法比較
幾種細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法（試劑）特點(diǎn)比較表
轉(zhuǎn)染方法 | 原理 | 主要應(yīng)用 | 特點(diǎn) |
陽離子聚合物 | 帶正電的聚合物與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán) 形成帶正電的 復(fù)合物后與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用，并通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞 | 除了具有陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率高，操作簡單，適用范圍廣，重復(fù)性好等特點(diǎn)外，還具有在體內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性低等特點(diǎn)，是新一代的轉(zhuǎn)染試劑。 |
陽離子脂質(zhì)體法 | 帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物，然后脂質(zhì)體上剩余的電核與細(xì)胞膜上的唾液酸殘基的負(fù)電 核結(jié)合；另一種解釋是通過細(xì)胞是內(nèi)吞作用而被進(jìn)入細(xì)胞。(若DNA濃度過高，中和脂質(zhì)體表面電核，而降低了與細(xì)胞的結(jié)合能力) | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞 | 使用方法簡單，可攜帶大片段DNA，通用于各種類型的裸露DNA或RNA，能轉(zhuǎn) 染各種類型的細(xì)胞，沒有免疫原性。雖在體外基因轉(zhuǎn)染 中有很高的效率，但在體 內(nèi)，能被血清清除，并在肺組織內(nèi)累積，誘發(fā)強(qiáng)烈的抗炎反應(yīng)，導(dǎo)致高水平的毒性，這在很大程度上限制了 其應(yīng)用 |
DEAE-葡聚糖法 | 帶正電的DEAE-葡聚糖與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞 | 瞬時轉(zhuǎn)染 | 相對簡便、重復(fù)比磷酸鈣好,但對細(xì)胞有一定的毒副 作用,轉(zhuǎn)染時需除血清且一 般只用于BSC-1,CV-1,COS 細(xì)胞系 |
磷酸鈣法 | 磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 染瞬轉(zhuǎn)染 | 不適用于原代細(xì)胞（所需的DNA濃度較高）,操作簡 便但重復(fù)性差,有些細(xì)胞不 適用 細(xì)胞建議用CSCL梯度離心，轉(zhuǎn)染是拷貝數(shù)較多 |
逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA) | 通過病毒中膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受 體相互作用而 進(jìn)入宿主細(xì)胞，之后反轉(zhuǎn)入酶 啟動合成DNA并隨機(jī)整合到宿主基因組中 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 特定宿主細(xì)胞 | 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等,但攜 帶基因不能太大（<8kb）, 細(xì)胞需處分裂期,需考慮安 全因素 |
腺病毒 (雙鏈 DNA) | 先和細(xì)胞表面 的受體結(jié)合，繼 而在αv整合 素介導(dǎo)下被細(xì) 胞內(nèi)吞 | 瞬時轉(zhuǎn)染 特定宿主細(xì)胞 | 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,需考慮安全因素 |
Biolistic顆粒傳遞法 （基因槍粒子轟擊法） | 將DNA用顯微重金屬顆粒沉 淀，再將包被好 的顆粒用彈道 裝置投射入細(xì) 胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放，表達(dá) | 瞬時性轉(zhuǎn)染 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 | 可用于：人的表皮細(xì)胞， 纖維原細(xì)胞，淋巴細(xì)胞系以 及原代細(xì)胞 |
顯微注射法 | 用顯微操作將 DNA直接注入靶 細(xì)胞核 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時轉(zhuǎn)染 | 轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限,多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動物的 胚胎細(xì)胞 |
電穿孔法 | 高脈沖電壓破 壞細(xì)胞膜電位，DNA通過膜上形 成的小孔導(dǎo)入 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞 | 適用性廣，除了質(zhì)粒外，還可轉(zhuǎn)染大的基因組 （>65kb）但細(xì)胞致死率高， DNA和細(xì)胞用量大， 需根 據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿 孔實(shí)驗(yàn)條件，拷貝數(shù)較少 1-20 |
