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Ramina 應用實例｜實時監(jiān)測細胞培養(yǎng)性能測試
前言
拉曼光譜在復雜水體系中反映組分微小變化的能力深化了該技術在生物制藥過程分析（如生物反應器中的細胞生長）方面的應用。拉曼光譜儀技術可以實時、原位和無損地監(jiān)測生物制藥生產過程，可用于復雜化學體系的連續(xù)過程監(jiān)測。拉曼光譜技術在生物反應過程中可檢測大量代謝物變化的能力已將該技術提升為強大的過程分析工具。
實驗概述
拉曼光譜分析光學探頭具有可重復使用的特點，通過減少運行間的可變性來提高過程監(jiān)測的可重復性和可靠性。Thermo Scientific™ Ramina™ 過程分析儀可匹配多個光纖探頭。MarqMetrix 生物反應器球形探頭是專為滿足生物工藝工業(yè)的要求而設計的，可以搭載到 Ramina 過程分析儀上使用。這些探頭具有快速、易于更換和連接以及耐用等特點，可以進行無菌處理，比如離線的高壓滅菌。
DynaDrive 一次性生物反應器(S.U.B.)是 S.U.B. 技術的最新產品，為大規(guī)模生物生產提供了更好的性能，并具備可擴展性。與傳統(tǒng)的 S.U.B. 設計相比，長方體的罐體具有幾個關鍵優(yōu)勢，包括*的混合和傳質能力以及更好的可擴展性。
本應用介紹了Ramina過程分析儀系統(tǒng)與 500L HyPerforma DynaDrive 生物反應器的集成，并實現(xiàn)關鍵過程參數(shù)(CPPs)的在線測量，通過采集整個細胞生長培養(yǎng)過程中連續(xù)生成的光譜數(shù)據(jù)建立起若干參數(shù)和代謝物的精確預測模型。
材料與方法
細胞培養(yǎng)和喂養(yǎng)策略
細胞培養(yǎng)在500L HyPerforma DynaDrive S.U.B 中進行（見下圖1），其中包含體積約為320L細胞培養(yǎng)基，在36.5℃，pH=6.9+/-0.3, DO=50%的條件下接種0.5x106個細胞/mL。體系的 pH 值通過添加二氧化碳氣體和碳酸鈉來控制。
細胞在化學定義的培養(yǎng)基中生長，從第3天開始每天進行兩步喂養(yǎng)過程。第一種喂養(yǎng)介質以起始體積的重量為4%添加，第二種喂養(yǎng)介質以0.4%添加。第6天體系溫度轉為33°C。試驗在14天后終止。生物反應器避光處理以防止雜散光干擾。在高壓滅菌后，將 Ramina 過程分析儀生物反應器球形探頭插入HyPerforma DynaDrive S.U.B. 中，進行在線實時拉曼光譜數(shù)據(jù)采集。
圖1.500L Thermo Scientific HyPerforma
DynaDrive S.U.B. 細胞培養(yǎng)罐
Ramina 過程分析儀測試
使用 Ramina 過程分析儀進行數(shù)據(jù)采集（見下圖2）， Ramina 過程分析儀的生物反應器球形探頭直接浸入在生物反應器(500L) 中，每平均20次測量獲取一張拉曼光譜數(shù)據(jù)，積分/曝光時間為3秒，激光功率設置為450mW。每個數(shù)據(jù)光譜的總采集時間為2分鐘，在 Ramina 過程分析儀用以建立模型數(shù)據(jù)與離線儀器分析通過匹配時間戳以確認。
圖2.Thermo Scientific™ Ramina™
在線拉曼分析儀
化學計量學模型建立
來自多臺 Ramina 過程分析儀、探頭和生物反應器的數(shù)據(jù)被用于創(chuàng)建模型。訓練數(shù)據(jù)集從每個生物反應器的45個樣本中收集，以創(chuàng)建每個化學計量學模型。對光譜數(shù)據(jù)進行了檢查，剔除了由宇宙射線引起的異常譜峰。選擇感興趣的光譜區(qū)域，并對光譜進行預處理，以去除基線干擾并優(yōu)化信噪比。
建模過程中測試了許多預處理技術，包括Savitzky Golay濾波、自動Whitaker平滑、多元散射校正、SNV和均值中心化。根據(jù)建模的關注點選擇優(yōu)化不同的預處理技術。為每個感興趣的組分創(chuàng)立偏最小二乘(PLS)模型并進行交叉驗證以測試每個模型的優(yōu)化的效果。這些組分包括葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、TCD、VCD和其他在生物反應器培養(yǎng)過程中產生的常見代謝物。
結果
在這項工作中，在線拉曼光譜儀應用于連續(xù)分批補料 CHO 細胞培養(yǎng)過程。使用拉曼光譜監(jiān)測工藝參數(shù)首先需要使用外部校準數(shù)據(jù)集（獨立離線數(shù)據(jù)）建立化學計量學模型，通過對感興趣的參數(shù)的離線分析數(shù)據(jù)和對應的在線拉曼光譜數(shù)據(jù)的關聯(lián)關系建立模型。
為了評估 Ramina 過程分析儀預測值的準確性，每天收集生物反應器數(shù)據(jù)并進行分析比較。計算每個參數(shù)(RMSEP)的校準均方根誤差(RMSEC)、交叉驗證均方根誤差 (RMSECV)和預測均方根誤差。根據(jù)模型的預測計算平均誤差，得到用于構建模型的 RMSECV。用模型未見過的“新"數(shù)據(jù)來測試模型，依據(jù)參數(shù)RMSEP判斷。為每個 PLS 模型記錄變異系數(shù) R2。該值用于確定模型預測變量（X 變量）可以解釋的 Y 變量的變化量。
值得一提的是，結合使用來自同一 CHO 培養(yǎng)過程的生物反應器運行的幾個大型獨立數(shù)據(jù)集，可以產生更準確和穩(wěn)健的預測化學計量學模型。在這項研究中，來自之前生物反應器運行的五個獨立數(shù)據(jù)集被組合起來訓練一個大型化學計量學模型。然后將校準模型應用于此次 Hyperforma DynaDrive S.U. B 生物反應器的預測。數(shù)據(jù)表明該模型能夠準確預測這個新數(shù)據(jù)集，并且模型預測與離線收集的眾多代謝物的數(shù)據(jù)測量高度相關，如下表1所示。
表1.模型預測值與離線數(shù)據(jù)的相關性
下圖為賽默飛Hyperforma DynaDrive S.U.B.化學計量學模型預測——各重要參數(shù)的拉曼預測模型和離線數(shù)據(jù)對比。
結論
可重復使用MarqMetrix生物反應器BallProbe 探頭具有TouchRaman浸沒技術，連接Ramina過程分析儀，可對500L HyPerforma DynaDrive S.U.B.中的關鍵過程參數(shù)葡萄糖、谷氨酰胺和乳酸以及總細胞密度和活細胞密度進行準確的在線實時預測。相關性分析顯示模型預測數(shù)據(jù)與離線分析數(shù)據(jù)之間具有良好的一致性，表明模型能穩(wěn)健地應用于上表1中所示參數(shù)的預測。