近日，北京大學工學院黃建永課題組在Nature Communications上在線發表了題為“Geometric constraint-triggered collagen expression mediates bacterial-host adhesion"的研究論文。本文基于多功能單細胞顯微操作系統FluidFM的單細胞力譜技術（Single cell force spectrum，SCFS）研究細菌與宿主細胞界面力學相互作用，并進一步定量表征了細菌與宿主細胞間的特異性粘附力，建立了細菌與宿主細胞單層相互作用的力-化學耦合模型，從力學生物學視角揭示了空間幾何約束誘導細菌與宿主細胞異質性粘附的時空動態規律，在此研究基礎上得出，有效抑制宿主細胞表面特異性粘附受體的表達可能會最大限度地減少細菌與宿主細胞之間的生物力學粘附，從而促進細菌的抗生素治療。這一點對于提高抗生素效力，避免臨床誤用具有至關重要的意義。
文中所使用的多功能單細胞顯微操作系統FluidFM的單細胞力譜技術，可在單細胞水平上提供高質量的力學數據，具有操作簡單、適用細胞種類多、通量高、力學范圍寬等優勢，為本文生物力學的研究提供了關鍵的數據支撐。
多功能單細胞顯微操作系統FluidFM
【研究背景】
細菌與宿主細胞之間的物理接觸和隨后的粘附是細菌感染的先決條件，由于高致病性細菌和耐藥細菌的存在，細菌感染已成為世界范圍內對人類健康嚴重的威脅之一。在細菌-宿主相互作用中，細菌首先借助于各種物理化學因子到達宿主表面，可能通過粘附素和細胞受體實現特異性粘附。一些細菌甚至在隨后的過程中內化到宿主細胞中，從而保護它們免受宿主免疫系統和抗生素的攻擊。越來越多的證據表明，細菌和宿主細胞的物理微環境，包括但不限于界面粘附力、細胞外基質(ECM)剛度和幾何約束，在調節它們的功能和行為中起著關鍵作用，從而影響細菌和宿主細胞之間的各種相互作用。例如，細菌粘附力作為致病力的一個重要因素，可以促進細菌毒素的傳播。機械生物學的新進展已經揭示了ECM的剛性通過細胞骨架重塑調節細菌-宿主相互作用和細菌內化。此外，在傷口愈合、細胞遷移和腫瘤形成等各種生物過程中普遍存在的宿主細胞的幾何約束被發現介導細胞形態、細胞-ECM粘附和細胞-細胞相互作用。據報道，組織形態發生和腫瘤進展本質上是由細胞牽引力和細胞間收縮應力之間的競爭調節的。同樣，細菌-宿主相互作用涉及復雜的生物物理相互作用，其中病原體可以操縱宿主細胞的機械轉導以促進傳播，而宿主細胞可能改變其防御策略以消除病原體。盡管在細菌宿主中存在著復雜的機械感應和機械轉導相互作用與周圍微環境，宿主細胞的空間幾何約束是否以及如何觸發它們的功能反應來調節與致病菌的物理相互作用仍然是一個謎。
【研究結果】
本文中科研團隊首先建立了一個典型細菌的體外模型，如金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，感染上皮細胞，如IEC-6細胞(大鼠小腸上皮細胞系6)和HaCat細胞(人角化細胞細胞系)，借助成熟的微接觸打印技術，允許致病菌感染生長在空間受限的細胞外基質上的宿主細胞單層。作者證明，由于宿主單層上存在二維(2D)幾何約束，細菌與宿主之間存在顯著的空間異質性相互作用。利用基于流體力顯微鏡FluidFM技術及單細胞力譜(SCFS)，作者量化了細菌和幾何限制的宿主單層之間的粘附力，從而揭示了這些力本質上是空間位置和基質剛度相關的。利用單細胞RNA測序(scRNA-seq)和(MC)模擬，作者進一步闡明了由幾何約束觸發的邊緣效應導致的宿主單層中膠原IV的異質表達在調節空間異質細菌-宿主粘附中起關鍵作用。最后，作者發現膠原IV抑制劑不僅可以有效減少異質粘連，而且可以作為抗生素佐劑來增強抗生素效力。
圖1. 利用基于FluidFM的SCFS定量表征單個細菌與微圖案宿主細胞單層之間的粘附力
【研究意義】
生活在幾何受限微環境中的細胞普遍存在于各種生理過程中，例如傷口愈合。然而，宿主細胞的空間幾何約束是否以及如何調節細菌與宿主的相互作用仍不清楚。本文研究團隊揭示了細菌與空間受限的細胞單層之間的相互作用表現出強烈的空間異質性，細菌傾向于粘附在受限制的單層外緣附近的這些細胞上。細菌粘附力在微圖紋單分子膜邊緣的粘附力可達75nN，是中心粘附力的3倍，這取決于底層基質的剛性。單細胞RNA測序實驗表明，具有顯著邊緣效應的IV型膠原在空間上的異質表達與位置依賴性細菌粘附有關。在此基礎上，研究團隊在動物實驗中發現，IV型膠原蛋白抑制劑可以作為佐劑來減少細菌粘附，從而顯著提高抗生素的療效。本文詳盡的工作不僅闡明了空間幾何約束微環境調控細菌-細胞界面粘附的力學生物學機制，也為抗生素輔劑的篩選和臨床上改善細菌抗生素治療方案提供了可借鑒的思路和策略。
【研究利器】
FluidFM技術在單細胞水平上提供高質量的力學數據
本文中FluidFM技術被用于對單細胞的黏附力進行測量。根據細菌和微球的大小(直徑1 μm, Sigma)，選擇開口(直徑300 nm)和彈簧常數(0.6 N/m)的FluidFM懸臂探針。懸臂梁靈敏度(S, m/v)用Sader方法標定。探針被0.1 mg/ml PLL-g-PEG包被20min，以減少非特異性細胞結合，然后在純凈水中洗滌5分鐘。在細胞力譜實驗中，通過施加負壓(- 200 mbar)將單個細菌緊緊固定在懸臂開口處。然后，帶有單個細菌的懸臂梁以1 μm/s的壓電速度接近選定的細胞，并在達到設定值(100 nN)時暫停30s與細胞相互作用。最后，以1 μm/s的壓電速度收回懸臂梁，獲得粘附力數據。
圖2. 細菌-宿主細胞的界面力學相互作用
FluidFM技術的主要優勢：
1. 技術可在單細胞水平上提供高質量的力學數據
2. 技術具有通量高、力學范圍寬等優勢，可直接抓取或者壓細胞。
3. 適用細胞種類：懸浮細胞、貼壁細胞均可測量
4. 力學范圍：nN到μN級別的細胞水平的力
5. 操作簡單：區別于AFM細胞力學測量，具有簡便、直接的優勢。
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