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單細胞測序在疾病診斷和細胞異質性研究中發揮著重要作用，單細胞測序已經讓我們能以全新的方式理解細胞的生化過程。然而目前的單細胞測序手段需要將細胞消化并裂解才能夠進行，而細胞狀態在這一操作中不可避免的會發生改變，因此很難掌握細胞真實的基因表達情況。近日，來自中國科學院深圳先進技術研究院研究員陳萬澤以第一作者身份在國際期刊Nature上發表長文，使用多功能單細胞顯微操作系統FluidFM創建了一種原位活細胞基因測序方法Live-Seq，這種方法能夠在不殺死細胞的情況下完成對細胞的測序工作。通過這種技術該團隊成功完成單細胞RNA基因測序，并通過這種方法檢測到了細胞的基因表達和細胞周期狀態變化。下面本文就這項工作的具體內容進行闡述。
1. Live-Seq測序技術簡述
由于單個細胞的RNA總量僅有10 pg。為了實現無損的單細胞測序，陳老師的團隊首先使用FluidFM對現有的scRNA-Seq單細胞測序的方法進行了優化。為了盡可能的接近Smart-Seq的測試條件，團隊采用了首先將緩沖液吸入探針，然后再進行細胞提取的操作。這樣可以確保所提取的RNA能夠第一時間與緩沖液混合，從而避免RNA的降解。通過這一方法，該團隊成功實現了IBA細胞的測序，證明了這種方法的可行性（圖1）。
圖1. Live-Seq技術
a. Live-Seq技術的示意圖和代表圖片，黑色箭頭指液體位置；b. IBA細胞測序的質量控制圖（n=10）。
2. Live-Seq技術分析細胞系和細胞狀態
為了證實Live-Seq的有效性，陳老師團隊對多種細胞系進行了測序，這其中包括IBA細胞、小鼠脂肪干細胞和祖細胞（ASPCs）以及脂多糖處理的RAW264.7細胞和Mock處理的RAW264.7細胞。通過對這些細胞系進行測序發現，該方法能夠區分上述細胞系，并且在特征基因檢測中能夠找到每種細胞所對應的特征基因，證明了Live-Seq方法的有效性（圖2）。
圖2. Live-Seq單細胞測序區分細胞型及細胞狀態
3. Live-Seq技術對細胞的活力基本沒有影響
Live-Seq技術的優勢在于提取過程中不會破壞細胞。通過對提取前后的測序對比可以發現，提取組與空白組之間的團簇沒有顯著性差異。并且通過對細胞形態的觀察中，發現細胞的形態基本沒有改變，并且多數細胞仍然能夠正常分裂（圖3）。
圖3. Live-Seq對細胞活力的影響
a. 細胞實驗的示意圖；b. Live-Seq測序后不同時間點（1h,4h）的scRNA-Seq的tSNE圖；
4. Live-Seq技術能夠記錄細胞下游分子表型事件
由于Live-Seq對細胞生理狀態影響小，因此能夠監測在細胞代謝過程中的基因變化。通過對比LPS處理的巨噬細胞周期實驗中發現，Live-Seq技術與對照組的細胞代謝水平相比沒有明顯變化，因此這種方法測量的數據十分接近細胞代謝中基因表達的真實水平。通過測序對比LPS處理與空白的測序結果發現Nfkbia與Tnf的表達非常相關。這一結果也驗證這種測序方法在檢測細胞下游表型時的優勢。
圖4. Live-Seq技術的單細胞縱向分析
5. Live-Seq技術對同一細胞多次測序
Live-Seq技術的無損性甚至能夠實現對單個細胞的多次測序。通過對單個細胞兩次提取后細胞活力變化的觀察中發現，細胞的活力即使在2次提取后仍沒有發生明顯的變化，基因型分析也沒有發現明顯的基因表型改變。
圖5. Live-Seq對細胞的多次提取，連續測序的示意圖和代表圖像；整合Live-Seq和scRNA-Seq的tSNE圖。
6. 總結
Live-Seq是一種十分具有前景的單細胞測序的新方法，得益于FluidFM技術的無損提取的優勢，Live-Seq技術除了能夠實現傳統測序的功能外，還降低了細胞的損傷，能夠提供更加原生和真實的測序信息。這種特點甚至讓單細胞的基因表達動力學研究成為可能。相信隨著這種技術自動化的提高，將為單細胞測序技術帶來更多可能。
參考文獻：
[1] Live-seq enables temporal transcriptomic recording of single cells, Wanze Chen, Orane Guillaume-Gentil, Pernille Yde Rainer, Christoph G. G?belein, Wouter Saelens, Vincent Gardeux, Amanda Klaeger, Riccardo Dainese, Magda Zachara, Tomaso Zambelli, Julia A. Vorholt, Bart Deplancke, Nature (2022); DOI: 10.1038/s41586-022-05046-9
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