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志賀氏菌熒光定量PCR檢測試劑盒實驗操作步驟

閱讀：2915 發布時間：2012-12-13

志賀氏菌屬產品介紹

本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術，用于志賀氏菌的PCR體外特異性檢測。檢測靈敏度為100拷貝/mL。定量檢測線性范圍為：10-1010拷貝/mL。

志賀氏菌屬試劑盒組成

規格	48次檢測
DNA提取液	3mL/管
志賀氏菌PCR反應液	1100µL/管
Taq酶（5U/µL）	24µL /管
志賀氏菌陽性對照	100µL/管
志賀氏菌陰性對照	100µL/管
說明書	1份

實驗操作步驟：

1. DNA提取：取增菌液1mL加到1.5mL無菌離心管中，10,000rpm離心5min，棄去上清；加入50µL DNA提取液，充分混勻后沸水浴5 min，13,000rpm離心5min，取上清液進行檢測或保存于-20℃以待檢測。

2. 擴增試劑準備（在試劑貯存和準備區完成）

2.1. 從試劑盒中取出PCR反應液，冰盒上融化后混勻。試劑在使用前2000rpm離心20s備用。

2.2. 設需要的PCR反應管管數為N（N = 待檢樣本數+ 1管陰性對照 +1管陽性對照）。

2.3. 混合液的配制：先吸取體積為22.6（µL）×N反應液1.5mL滅菌離心管，再加入Taq DNA聚合酶0.4 （µL）×N，混勻后2000rpm離心20s，然后向N 個0.2mL PCR反應管中分裝已加入Taq酶的混合液23µL/每管，蓋緊管蓋。

2.4. 注意：陰性對照管建議在此區中加入2µL陰性對照樣品。

3. 加樣（在樣品制備區完成）

3.1. 陽性對照取出解凍，使用前2000rpm 離心20s。

3.2. 將保存在-20℃的核酸提取物置室溫解凍，以13,000rpm離心5min；向N個PCR管中分別加入待檢樣本DNA（包括陽性對照）2µL，蓋緊管蓋，2000rpm離心20s，將PCR反應管轉移核酸擴增區。注意做好樣品號標記。

4. PCR擴增（在核酸擴增區完成）

4.1. 上機前應檢查各反應管是否蓋緊。

4.2. 反應體系設為25µL；熒光信號采集設定在退火溫度。對于多通道熒光PCR儀，選擇熒光素FAM為信號采集通道。

4.3. PCR循環參數為：*階段，95℃ 3 min預變性；

第二階段，[95℃ 10s；60℃ 40s] × 40次循環。

注意：在的LightCycler上使用，變性溫度95℃改為93℃，其他不變。

5. 質量控制標準及結果判斷

5.1 綜合分析儀器給出的各項數據及擴增曲線，設定合理的閾值（Threshold）和基線（Baseline），使儀器給出正確的結果。

5.2 陰性對照CT值應顯示為0或≥40.0，陽性對照的CT值應≤30.0，否則視實驗失敗，需重做。

5.3 檢測樣品CT≤35.0，結果有效，可直接報告樣品陽性。

5.4 檢測樣品35.0<CT>40.0，需進行一次重復實驗，若CT仍介于35.0和40.0之間，且曲線有明顯的指數增長特性，同時陰性對照Ct值為零，可報告樣品陽性，否則報告樣品陰性。

5.5 檢測樣品CT值為零，報告樣本陰性。

注意事項

1. 本試劑盒僅用于體外檢測使用，操作人員必須經過培訓并具有一定的經驗，試劑盒使用前請仔細閱讀說明書全文。

2. 請嚴格按照基因擴增檢驗實驗室的管理規范進行實驗操作。

3. PCR實驗嚴格分區操作；各區應有的手套、移液器等，不得交叉使用，避免污染；工作人員應遵循從一區到二區的單方向工作原則，各工作區相對隔離；進行PCR實驗的工作桌面和及相關物品應定期用1%次氯酸鈉、75%酒精、1mol/L鹽酸或紫外燈進行滅菌和消毒。

4. 試劑盒中各試劑充分融化后請短暫離心。反應液分裝時應盡量避免產生氣泡。上機前應注意檢查各反應管是否蓋緊，以免污染儀器。

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