清洗鍵合硅膠反相色譜柱時，有時使用有機溶劑是不能去除色譜柱上的污染物的。如果金屬離子被硅膠吸附或與鍵合，這種情況就特別明顯了。這時，可以使用螯合試劑如0.05M的乙二胺四乙酸（EDTA）來沖洗色譜柱。EDTA會同許多金屬形成絡合物，并把他們進行溶解。在使用過了EDTA后，你可以用水*沖洗色譜柱。如果樣品基體含有一些離子性的化合物，可以改變pH值使其變成非離子狀態，然后用水—有機溶劑混合溶劑進行沖洗。
為了控制緩沖體系和
色譜柱中殘留緩沖液中的細菌生長，色譜工作者可以使用一些家用的漂白劑稀釋到1：10或1：20，用50個柱體積過柱，接著再用50個柱體積的液相色譜級的水進行沖洗。不能讓漂白劑流經檢測器，因為它會破壞流通池。為了防止溶劑瓶中的細菌生長，應該當天配制足夠使用的緩沖液，并將不用的緩沖液存放在冰箱中，并加入0.1%的*，不允許在沒有流速的情況下使緩沖液長時間駐留在色譜柱中。
色譜工作者往往會討論使用離子對試劑之后對色譜固定相柱產生的影響。一些離子對試劑如辛磺酸（用于陽離子）和四丁基溴化銨（用于陰離子）在含有某些有機改性劑的條件下會強烈地吸附在鍵合硅相的表面。色譜柱受到了污染不可能再生到他們的初始狀態，這只能說用于離子對色譜的色譜柱需要為這門技術而獻身，而且永遠無法再用于常規的反相液相色譜。
反相液相色譜柱會由于一些含強保留成分的樣品基體的反復進樣而造成污染，尤其是一些分子量高的、親水性比較強的化合物、如蛋白質這樣的生物流動性組成和一些會吸附在硅醇基上的強堿性物質。另外，某些流動相添加試劑如離子對試劑和表面活性劑會吸附在填料表面并改變其性質。被污染的色譜柱會產生糟糕的峰形、假的可重復的保留性、高的反壓力和基線干擾。通常一些能夠破壞污染物與色譜柱鍵合或硅膠表面反應的有機溶劑和試劑可以用來清洗色譜柱。
色譜工作者需要小心謹慎，因為這些試劑本身有很強的破壞作用，使用時會造成固定相本身的損壞。此外，通過使用樣品的前處理過程，盡可能少地接觸到污染物的樣品，來防止色譜柱受污染是一個很好的步驟。在所有的應用中，強烈推薦使用保護柱來防止色譜柱的污染并對分析柱可能造成的傷害。
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