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大量制備血清噬菌粒克隆
閱讀：658 發布時間：2010-7-30[器材和試劑]
● LB+Amp
● LB+Amp/Glu[LB ，50ug/ml Amp，l％葡萄糖]
● IPTG
● M13K07輔助噬菌體（Stratagene）
● PEG 8000（Sigma）
● NaCl
● TBS
● SW40異質同晶聚合物管（Beckman）
[方法]
1．將含有單克隆噬菌粒的菌落接種到10ul LB+Amp/Glu中，37℃過夜培養（在lac啟動 子的控制下，葡萄糖能抑制pⅧ基因的表達）。
2．用500ml LB+Amp稀釋過夜培養液，使之OD600＝0．05；并在37℃下用2L燒瓶劇烈 振蕩培養（至少300r/min），直到OD600＝0．25。
3．37℃極溫和攪動孵育15分鐘。加入IPTG（終濃度為0．1mmol/L）誘導源自lac啟動 ·子的pⅧ表達，并用輔助噬菌體M13K07（mol＝30）進行超感染。混合并在37℃下靜置15分鐘感染。37℃劇烈振蕩孵育培養物5小時。
4．將細菌/噬菌體上清在4℃5000r/min離心30分鐘，回收上清液。
5．加PEG 8000和NaCl溶液（其終濃度分別為4％和0．5mol/L）沉淀噬菌體顆粒，4℃冰上4小時。
6．4℃5000r/min離心40分鐘回收噬菌體沉淀，并用1/10原體積的TBS重懸。
7．70℃水浴孵育噬菌體上清30分鐘，使污染的細菌蛋白變性；再4℃10000r/min離心30分鐘除之。
8．將PEG 8000/NaCl加入所得到的上清，再次沉淀噬茵體，4℃冰上孵育2小時。
9．4℃10000r/min離心30分鐘， 用10ml PBS重懸噬菌體沉淀。 以8000r/min再次離心15分鐘，以去除不溶物質。
10．在LB+Amp平板上滴定噬菌體TU值。