化工儀器網
公司動態
噬菌體抗體文庫構建
閱讀：1394 發布時間：2010-7-23總體上，可以構建兩大類抗體文庫：免疫文庫或天然文庫。免疫文庫是用免疫球蛋白（Ig）可變區（V）基因制備而成的，這些基因或來自免疫人群，或來自小鼠；其中的V基因高度偏向于能識別免疫原的抗體。因而，免疫文庫中分離的抗體親和力，遠高于那些分離自同等規模天然文庫的抗體。這些抗體文庫同樣可用來選擇針對非免疫抗原的抗體。天然文庫的構建意圖是讓抗體文庫沒有偏好性，從而可以從中選擇到針對各種各樣抗原的抗體。它們或來自天然的未免疫人體的重排V基因，或來自合成的人V基因。總體而言，所選擇抗體的親和力與相應的抗體文庫容量是成比例的；其Kde值在較小抗體文庫的10-6～10-9mol/L到較大抗體文庫的10-9mol/L之間。這一發現與理論推測是一致的。
對天然V基囪抗體文庫和合成的V基因抗體文庫進行比較可以發現：天然V基因文庫 與同樣規模的合成V基因抗體文庫相比，可產生具有更高親和力的抗體。這也許是由于合 成文庫中所采用的互補決定區域（CDR）殘基不能為抗體結構所接受，或是由于產生了不能以高親和力結合的抗體結構。采用聚合酶鏈反應（PCR）以此方法制備合成行V區基因，同樣可導致在可變區出現框移和終止密碼子。要解決此問題，可以用三核苷酸替代單堿基來合成寡核苷酸，盡管此項技術成本高昂且未廣泛普及。至于合成性scFv折疊不佳問題的解決，可以先用一個能識別V區構象表位的配體，如蛋白A或蛋白L，除去預先選擇正確折疊的VH和VL基因（I．M．To mlinson），盡管這于已知能結合此類蛋白的VH和VL基因的抗體文庫構建。使用合成性V區基因的優點是：可以挑選或工程化那些已知能在細菌中良好表達的V基因，盡管CDR區內單個氨基酸改變也許會導致細菌表達水平的迥異。現已用合成性三核苷酸技術建立了一個抗體文庫。這個技術可以利用旁側限制性位點讓合成性序列插入CDR區的任何位置：這對于隨后的抗體親和力成熟尤其有用。
盡管在理論上，抗體文庫的構建有多種不同的選擇，不過大多數已發表的研究工作傾向于按照一種業已嘗試并且驗證過的實驗方案進行。尤其是以絲狀噬菌體為基礎的噬菌粒載體以及用pⅢ作為展示蛋白，幾乎成為了*。大多數抗體文庫采用scFv模式，但也有一些采用Fab模式。Fab包括兩條鏈，即VH—CH1和VL-CL，需要將兩者組裝為一體。另一方面，scFv則是一條含有兩個V區結構域的單鏈蛋白，其中這兩個結構域通過一個柔性連接頭共價地結合在一起。總體上，Fab在噬菌體上更難組裝并也更可能降解；其作為可溶性抗體片段的產量也更低；同時，由于具有較大的編碼DNA分子，因此，也更易出現噬菌體（粒）中DNA分子不穩定的問題。所有這些問題的產生都源于這樣一個事實：Fab含有兩條需要組裝的蛋白鏈，而每條鏈的大小都與單個scFv相當。然而，Fab似乎并不存在困擾scFv片段的二聚化或凝集問題，而且，有一個已發表的天然Fab文庫與許多已發表的scFv文庫相比似乎有同樣的效率。scFv的主要問題之一是其具有易于形成二聚體的傾向，即一條scFv的VH與另外一條scFv的VL發生相互作用。如果連接片段較短，這個問題將更加嚴重。已有人利用這種二聚體的形成來構建二聚化抗體（成為二體），其中的每個單體都可以表達不同的抗體特異性。這樣一個概念，已擴展到每個噬菌體攜帶兩種抗體特異性的噬菌體抗體文庫的構建之中。
抗體結構和用于噬菌體展示的重組形式。
被展示的重組抗體的基因結構。
構建于pⅢ上的以噬菌粒為基礎的scFv抗體文庫。實際上，與肽庫不同，所有抗體文庫都是在噬菌粒載體中構建的。隨后的載體優化包括六組氨酸標簽的出現和表位標簽替換，都未從根本上改變這個載體的性質。使用噬菌粒載體的原因有兩點：首先，噬菌粒載體具有比噬菌體載體更高的轉化效率，因此可以構建明顯大很多的抗體文庫；其次，噬菌粒展示基本上都是抗體片段的單價展示，這樣就允許依據結合常數對抗體進行更高的選擇。采用噬菌粒載體必須用輔助噬菌體進行噬菌體救援，輔助噬菌體可以反式提供其他的噬菌體蛋白。
pHENl噬菌體展示載體。