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用scFv接頭PCR裝配VH和VL進行scFv基因文庫的構(gòu)建
閱讀：854 發(fā)布時間：2010-7-21器材和試劑]
● PCR試劑和設(shè)備
● Geneclear試劑盒（Qbiogene，Inc．）
● V區(qū)特異性正向（JΚFOR和JΛFOR）和反向（VuBACK）PCR引物
● scFv接頭DNA
[方法]
1．在0．5ml微量離心管內(nèi)配制以下PCR反應(yīng)混合液。配制成2個“反應(yīng)管”，1個含有 V。文庫DNA，另1個則含有Vl文庫DNA。
反應(yīng)管 對照1 對照2
● scFV接頭DNA（100ng/ul） 1．0ul 1．0ul
● VH文庫DNA（100ng/ul） 3．5ul 1．0ul
● V-文庫DNA（Vκ或Vλ）（100ng/ul） 3．0ul 1．0ul
● 水 6．5ul 5．5ul
2．在每管中加入：
● 水，33ul
● 10×Vent緩沖液，5．0ul
● 20×dNTP， 2．5ul
3．在熱循環(huán)儀格內(nèi)加熱反應(yīng)管到94℃，5分鐘。如果沒有加熱蓋，則滴加1滴輕質(zhì)礦物油覆蓋反應(yīng)液（Sigma）。
4．加入2．Ogl Vent DNA聚合酶。
5．以94℃1分鐘、65℃1分鐘、72℃2分鐘的條件共循環(huán)7次，隨機地連接片段。
6．7次循環(huán)后，保持94℃；每套旁側(cè)引物各加入lul（等物質(zhì)的量的6種VHBACK引物的混合物、等物質(zhì)的量的5種JκFOR或JλFOR引物的混合物，使每種引物混合液zui終總濃度達到10pmol/ul）。
7．以94℃ 1分鐘、60℃ 1分鐘、72℃ 1分鐘，共25個循環(huán)擴增片段。
8．取3ul PCR反應(yīng)物， 以確定剪接是否成功。已裝配好的scFv長度應(yīng)為0．8～0．9kb，而且在陰性對照反應(yīng)中沒有相同大小的產(chǎn)物。
9．用1．0％瓊脂糖凝膠電泳純化已裝配好的基因文庫，再用Geneclean提取。將每種產(chǎn)物重懸于20ul水中。在1％瓊脂糖凝膠中，與已知大小和濃度的標(biāo)準(zhǔn)對照品比較，測定DNA濃度。為構(gòu)建抗體文庫，已剪接的scFv基因文庫接著必須進行再擴增，添加上限制性位點以便能克隆到噬菌粒載體中