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的轉錄因子的*鏈cDNA合成試劑盒被設計，以反轉錄核糖核酸（mRNA，總RNA，病毒RNA，并在體外轉錄的RNA）為以下的應用程序從各種來源：

• 研究基因的表達水平，通過兩步法RT-PCR，RT-PCR定性或定量RT-PCR的LightCycler ^®旋轉木馬為基礎的系統，在LightCycler^® 480系統，或其他實時工具。
• 生成的cDNA文庫，全長插入。
• 克隆基因的興趣。

該套件包含使用傳統的熱循環儀和實時PCR儀器的cDNA反應所需的所有組件。此外，50反應的包裝尺寸包括10個控制反應。

對于許多應用程序進行了優化

• 使用與傳統的熱循環儀和實時PCR儀器。
• 優化實時PCR -該試劑盒在LightCycler ^®旋轉木馬為基礎的系統，在LightCycler ^® 480系統，和其他實時測試。
• 超過至少10 輸入的RNA（體外轉錄子）的⁸倍的范圍內，允許具有非常低或非常高的表達水平的基因分析，獲得的線性量化。
• 生成高效的qPCR的曲線，具有高的熒光強度和相同的RNA稀釋之間的距離，允許一個簡單的分析的結果（圖1）。
• 獲得可靠的和敏感的結果 - 有沒有添加劑的RT緩沖系統的干擾 - 抑制 - 隨后的PCR。

魯棒性

• 轉錄多種模板，即使是困難的（例如，富含GC的RNA與高二級結構）。
•  實現高??再現性（圖2）。
• 生成與錨定的寡聚（dT）₁₈引物的試劑盒中包含的全長轉錄。
• 獲得高達14 kb的（圖3）的cDNA轉錄。

靈活性

• 使用三種不同的吸方法-隨機六聚體，錨定的寡聚（dT）₁₈，和序列特異性引物-根據所需的分析的類型。

轉錄因子逆轉錄-該套件的核心組成部分-是一種重組的逆轉錄酶表達的E. 大腸桿菌。酶RNA指導的DNA聚合酶活性，DNA依賴性DNA聚合酶活性，開卷活性和RNase H活性降解RNA中的RNA：DNA雜交體。后者繞過需要執行一個額外耗時的核糖核酸酶H孵育步驟后逆轉錄。這縮短了反應時間，降低了成本。建議用于RT-PCR，因為其具有高的熱穩定性的組合的高靈敏度的轉錄因子的逆轉錄酶合成cDNA全長產品（多達14 kb的），并且可以用于在溫度高達65 °C。由于其熱穩定性，轉錄因子的逆轉錄推薦用于富含GC的模板，具有高的二次結構，而不需要包括在反應中的添加劑。的試劑盒提供了*鏈cDNA的合成反應所需的所有試劑。吸，三個不同的引物系統都可以使用。兩個cDNA合成引物中所提供的試劑盒：隨機六聚體引物和一個錨定的寡聚（dT）₁₈引物。后者被設計成結合在開始的聚（A）尾產生全長cDNAs和防止從內部站點的poly（A）尾的吸。長的mRNA的5'末端的人數往往不多，因此，該預充方法對于大多數應用是優選的。使用隨機六聚體引物，使吸統一表示所有RNA序列的RNA的整個長度，并允許不攜帶的poly（A）尾的RNA的逆轉錄。耐熱保護RNase抑制劑包括在套件中，以保護RNA的在高的反應溫度下的降解。




 

逆轉錄酶
轉錄因子逆轉錄-該套件的核心部件-是一個高度敏感的，高耐熱性，重組的逆轉錄酶。酶RNA指導的DNA聚合酶活性，DNA依賴性DNA聚合酶活性，開卷活性和RNase H活性（降解RNA的RNA：DNA雜交）。后者的活動的存在下，繞過一個額外耗時的核糖核酸酶H孵育步驟反轉錄反應后的需要。因此，轉錄因子的反轉錄酶*鏈cDNA合成酶是一種理想的。

可以使用的酶，在溫度高達65A℃。由于轉錄因子逆轉錄酶的熱穩定性，能準確地抄寫富含GC的模板，有大量的二級結構。此屬性的轉錄因子的逆轉錄酶消除了需要特殊的反應增強添加劑。

隨機六聚體引物
的隨機六聚體引物（包括在試劑盒中）的整個長度，以確保所有的RNA序列的反轉錄的RNA的綁定。這些引物也可以不進行聚（A）尾巴的RNA的反轉錄。

錨定的寡聚（dT）₁₈引物
的錨定的寡聚（dT）₁₈ 引物（試劑盒中包含的）被設計為在開頭的poly（A）尾（而非內隨機尾巴）結合，以產生全長cDNAs 。由于長的mRNA的5'末端中經常未被在cDNA的混合物，這對于大多數應用，優選引物。

保護核糖核酸酶抑制劑
耐熱保護核糖核酸酶抑制劑（包括在套件中）在較高的反應溫度保護RNA的降解。

1. 轉錄因子逆轉錄酶
2. 轉錄因子的RT反應緩沖液，5倍濃縮
3. 保護核糖核酸酶抑制劑
4. dNTP混合液，PCR級
5. 錨定寡（dT）₁₈引物
6. 隨機六聚體引物 
7. 對照RNA -純化的永生化細胞系的總RNA組分的K-562。注：  包括僅在50-反應包裝大小 
8. 控制PBGD引物組合（正向和反向引物）注：僅包括包裝尺寸在50-反應 
9. 水，PCR級

圖1：量化的G6PDH基因的轉錄因子的*鏈cDNA合成試劑盒和在LightCycler ^® 2.0儀器。

將不同量的從K-562細胞的總RNA進行反轉錄，使用隨機六聚體引物和反應條件，電池組中的插入物的概述試劑盒。隨后的PCR為G6PDH基因和在LightCycler ^®快速啟動DNA法師SYBR Green I的試劑盒的特異性引物進行藍色曲線：轉錄因子的*鏈cDNA合成試劑盒。紅色曲線： RNA酶H ^-突變體的M-MuLV逆轉錄酶從供應商處A. 轉錄因子*鏈cDNA合成試劑盒產生一個更好的形狀，更高的熒光強度，和較低的交叉點的曲線，此外，磷酸葡萄糖脫氫酶基因的表達模式的一個簡單的分析相比，從供應商A的產品的在更寬的線性范圍和動態檢測范圍是可能的。圖2：定量的H-的HPRT基因與轉錄因子的*鏈cDNA合成試劑盒，在LightCycler ^® 480儀器，使用轉錄因子的*鏈cDNA合成試劑盒，總RNA反轉錄的隨機六聚體吸100毫微克/ 10皮克/轉錄的RNA的反應的反應使用了在隨后的PCR。在LightCycler ^® 480儀器的使用，重復18倍的H-HPRT可以檢測到高重現性（三角洲CP從0.29至1.06不等，這取決于對稀釋）。圖3：在兩個轉錄因子的*鏈cDNA合成試劑盒的性能步RT-PCR檢測。總RNA反轉錄，使用錨-寡聚（dT）₁₈引物，反應條件的產品的包插入在概述。在隨后的PCR中，使用了5微升cDNA反應。30個循環后，將PCR產物在瓊脂糖凝膠上分離，泳道1，2：起始原料為：人骨骼肌總RNA;片段的擴增：肌營養不良蛋白基因，PCR組件：高保真PCR擴增系統。泳道3：起始原料為：人力肝臟總RNA片段：載脂蛋白B（Apo B）基因PCR成份：高保真PCR擴增系統。弄4：起始材料：人類骨骼肌總RNA片段：抗肌萎縮蛋白基因的PCR組件：高保真PCR擴增系統。泳道5 - 9：材料：人類骨骼肌總RNA片段：抗肌萎縮蛋白基因的PCR組件：展開長模板PCR系統。圖4：硼替佐米曝光了廣泛的蛋白酶基因在神經母細胞瘤SH-SY5Y后表達的改變。 RNA 200萬個神經母細胞瘤細 ??胞分離高純度的RNA提取試劑盒。基因轉錄，轉錄因子的*鏈cDNA合成試劑盒。實時定量RT-PCR技術在LightCycler ^® 480儀器使用的LightCycler ^® 480探頭碩士和實時準備蛋白酶自定義面板。Cp值的硼替佐米處理的樣品之間的差異和六個控制測定的平均值作圖。使用5個看家基因的Cp值進行標準化。酒吧代表SD（n = 6）。進一步的實驗細節描 ??述在癌癥研究中的應用注釋2。好心提供的，H. BartiJuhász，塞梅爾魏斯大學，布達佩斯，匈牙利的數據。