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轉錄因子的高保真cDNA合成試劑盒反轉錄RNA與其他反轉錄酶相比，提高保真度。該套件提供高保真反轉錄酶，轉錄因子的重組逆轉錄酶和校對優化兩步法RT-PCR介導酶的混合，使這個產品的*：

 

• 克隆基因的興趣
• 測序轉錄
• 與大，全長刀片的生成cDNA文庫
• 生成的基因表達分析，RNA拼接的分析等。

作為該試劑盒在LightCycler ^®  工具及其他實時PCR儀器進行了測試，產品也定量RT-PCR的應用程序需要高保真的理想選擇。
該套件包含所有所需的組件合成cDNA適合直接用在定性RT-PCR與傳統的熱循環儀或定量RT-PCR實時PCR儀器上。50-反應包裝尺寸還包括10個控制反應（控制的RNA和控制的引物組合）。

反轉錄過程中提高準確度。

• 受益于優化的酶與其他常用的反轉錄酶（圖1）相比，共混物與7倍更高的保真度。
• 依靠真正的高保真數據，由數百萬個堿基的測序的基因組測序20系統。

結合精度，靈敏度高，產量高，全長轉錄。

• 生成全長轉錄至14 kb的與錨定的寡聚（dT）₁₈引物的試劑盒中包括（圖2）。
• 獲得良好的收益。
• 檢測低拷貝數模板，反轉錄低至10頁模板RNA（圖3）。
• 轉錄多種模板，即使是困難的（如，富含GC的RNA與高二級結構），在溫度高達55°C

更快地獲得結果。

• 降低逆轉錄反應時間只需10分鐘（圖4）。
• 爭取成為*個完成（圖5）。

該套件的核心組件的轉錄因子的高保真反轉錄酶，融合的重組逆轉錄酶和校對調解酶。兩種酶之間的協同作用是反轉錄的RNA模板與7倍的更高的保真度相比其他常用的逆轉錄酶的摻混物的能力的關鍵。

的轉錄因子的高保真逆轉錄酶混合物有效的反轉錄模板高達14 KB的。逆轉錄由于兩個酶組分的高耐熱性和特別優化的緩沖系統，能夠在溫度高達55℃。這允許逆轉錄富含GC的具有高的二次結構的模板，而無需包括添加劑，可能會產生負面影響的反轉錄反應的準確性。

重組逆轉錄酶的表達在大腸桿菌中包含的酶的混合物的 大腸桿菌。酶RNA指導的DNA聚合酶活性，DNA依賴性DNA聚合酶活性，開卷活性和RNase H活性降解RNA中的RNA：DNA雜交體。后者繞過需要執行一個額外耗時的核糖核酸酶H孵育步驟逆轉錄后，還原反應的時間和成本。

該工具包提供*鏈cDNA合成反應所需的所有試劑。吸，三個不同的引物系統都可以使用。兩個cDNA合成引物中所提供的試劑盒：隨機六聚體引物和一個錨定的寡聚（dT）₁₈引物。后者被設計成結合在開始的聚（A）尾產生全長cDNAs和防止從內部站點的poly（A）尾的吸。長的mRNA的5'末端的人數往往不多，因此，這對于大多數應用，優選預充方法。使用隨機六聚體引物，使吸統一表示所有RNA序列的RNA的整個長度，并允許不攜帶的poly（A）尾的RNA的逆轉錄。耐高溫，保護RNA酶抑制劑（包括在套件中）在較高的反應溫度保護RNA的降解。

逆轉錄病毒的逆轉錄酶通常用于cDNA合成的，表現出更高的核酸分析方法中使用的其它DNA聚合酶的錯誤率比。這種缺乏精度導致基站交流或移碼，這在隨后的PCR反應中被進一步傳播到一個顯著的數量。高保真PCR酶（校正）已經面世多年，羅氏應用科學的新的高精度逆轉錄酶能合成高收益的全長cDNA。

高突變率是逆轉錄病毒復制的一個標志。這源于由病毒編碼的逆轉錄酶，它轉換到雙鏈DNA病毒的基因組RNA中的基因組的復制機制。在此過程中，反轉錄產生頻繁的復制錯誤。這種不性的一個*的解釋是RT 3'-5'外切核酸酶活性的缺乏。的反向轉錄酶的天然高錯誤率不是適合于許多不同的應用。

1. 高保真轉錄因子逆轉錄酶（混合重組的逆轉錄酶和校對調解酶）
2. 轉錄因子的高保真反應緩沖液，5倍濃縮
3. 保護核糖核酸酶抑制劑
4. dNTP混合液，PCR級
5. 錨使用oligo（dT）₁₈引物
6. 隨機六聚體引物
7. DTT
8. 水，PCR-級
9. 對照RNA - 純化的總RNA組分的永生化細胞系K-562 *
10. 控制PBGD引物混合物（正向和反向引物）*

*僅包括包裝大小在50-反應。

由圖1的轉錄因子的高保真反轉錄酶和一種常用的M-MuLV逆轉錄酶的準確性。錯誤率測序基因組測序20系統。RNA反轉錄的轉錄因子高保真逆轉錄酶和常用的M-MuLV逆轉錄酶。的反向轉錄酶的純化的cDNA和校對聚合酶擴增后，錯誤率計算減去攜帶相同的序列的質粒DNA進行PCR對照的錯誤率。的轉錄因子的高保真度ReverseTranscriptase的錯誤率是四個獨立的實驗，其中在至少3.1×10 ⁶堿基進行測序的平均值。對于M-MuLV逆轉錄酶，4.5×10 ⁶堿基進行測序。
精度被表示為-1，錯誤率平均成功被反轉錄是由一個單一的轉錄錯誤之前的堿基數。轉錄因子的高保真度逆轉錄示出更高的精度比標準M-MuLV逆轉錄酶，所得cDNA的合成過程中在較低的錯誤率。

圖2：比較不同的逆轉錄總RNA反轉錄為不同的片段大小。

總RNA（1微克1微克從HeLa細胞的總RNA為5.4 kb和9.4 kb的片段從人體肌肉總RNA為2.3 kb的片段; 2微克的12.4 kb的片段）的大鼠腦總RNA反轉錄具有不同的反轉錄酶，根據制造商的建議。5微升等分每個基因的反應與羅氏的展開長距離dNTPack，隨后被放大。結果表明，轉錄因子高保真cDNA合成試劑盒有效地轉錄從其他供應商的逆轉錄酶相比更大的產量和特異性片段的大小與范圍廣泛的。

圖3：比較用于cDNA反應的不同的孵育時間，使用的轉錄因子高保真cDNA合成試劑盒。

1微克的HeLa細胞的總RNA的逆轉錄所示的時間，在50℃。五微升等份的8.5 kb DNA段的引物進行擴增的cDNA反應，使用羅氏公司的展開長距離dNTPack的。所有反應均進行雙份。研究結果表明，轉錄因子高的保真度的cDNA合成試劑盒有效抄寫RNA具有較高的速度和準確性的。

圖4：用于cDNA反應的不同的溫育時間，使用比較。

所示的時間，在50℃1μg的HeLa細胞的總RNA反轉錄。取5微升的8.5 kb DNA段的引物進行擴增的cDNA反應，使用羅氏應用Sciende的展開長距離dNTPack的。所有反應均進行雙份。

圖5：*完成轉錄因子的高保真cDNA合成試劑盒。 

轉錄因子的高保真cDNA合成試劑盒相比，我的cDNA合成試劑盒，包括核糖核酸酶H ^- M-MULV 供應商降低總的反應時間約1小時。

圖6： 合成后至1小時，在室溫下貯存cDNA，沒有松動性能。圖7：在整個溫度范圍內的困難模板的擴增。



在不同溫度下的GC含量在74％的富含GC的RNA與逆轉錄與轉錄因子的高保真cDNA合成試劑盒。5微升等分的每一個基因的反應，隨后與羅氏應用科學部的展開長模板PCR系統擴增。