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的轉(zhuǎn)錄因子的*鏈cDNA合成試劑盒被設(shè)計(jì)，以反轉(zhuǎn)錄核糖核酸（mRNA，總RNA，病毒RNA，并在體外轉(zhuǎn)錄的RNA）為以下的應(yīng)用程序從各種來源：

• 研究基因的表達(dá)水平，通過兩步法RT-PCR，RT-PCR定性或定量RT-PCR的LightCycler ^®旋轉(zhuǎn)木馬為基礎(chǔ)的系統(tǒng)，在LightCycler^® 480系統(tǒng)，或其他實(shí)時工具。
• 生成的cDNA文庫，全長插入。
• 克隆基因的興趣。

該套件包含使用傳統(tǒng)的熱循環(huán)儀和實(shí)時PCR儀器的cDNA反應(yīng)所需的所有組件。此外，50反應(yīng)的包裝尺寸包括10個控制反應(yīng)。

對于許多應(yīng)用程序進(jìn)行了優(yōu)化

• 使用與傳統(tǒng)的熱循環(huán)儀和實(shí)時PCR儀器。
• 優(yōu)化實(shí)時PCR -該試劑盒在LightCycler ^®旋轉(zhuǎn)木馬為基礎(chǔ)的系統(tǒng)，在LightCycler ^® 480系統(tǒng)，和其他實(shí)時測試。
• 超過至少10 輸入的RNA（體外轉(zhuǎn)錄子）的⁸倍的范圍內(nèi)，允許具有非常低或非常高的表達(dá)水平的基因分析，獲得的線性量化。
• 生成高效的qPCR的曲線，具有高的熒光強(qiáng)度和相同的RNA稀釋之間的距離，允許一個簡單的分析的結(jié)果（圖1）。
• 獲得可靠的和敏感的結(jié)果 - 有沒有添加劑的RT緩沖系統(tǒng)的干擾 - 抑制 - 隨后的PCR。

魯棒性

• 轉(zhuǎn)錄多種模板，即使是困難的（例如，富含GC的RNA與高二級結(jié)構(gòu)）。
•  實(shí)現(xiàn)高??再現(xiàn)性（圖2）。
• 生成與錨定的寡聚（dT）₁₈引物的試劑盒中包含的全長轉(zhuǎn)錄。
• 獲得高達(dá)14 kb的（圖3）的cDNA轉(zhuǎn)錄。

靈活性

• 使用三種不同的吸方法-隨機(jī)六聚體，錨定的寡聚（dT）₁₈，和序列特異性引物-根據(jù)所需的分析的類型。

轉(zhuǎn)錄因子逆轉(zhuǎn)錄-該套件的核心組成部分-是一種重組的逆轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)的E. 大腸桿菌。酶RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性，DNA依賴性DNA聚合酶活性，開卷活性和RNase H活性降解RNA中的RNA：DNA雜交體。后者繞過需要執(zhí)行一個額外耗時的核糖核酸酶H孵育步驟后逆轉(zhuǎn)錄。這縮短了反應(yīng)時間，降低了成本。建議用于RT-PCR，因?yàn)槠渚哂懈叩臒岱€(wěn)定性的組合的高靈敏度的轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA全長產(chǎn)品（多達(dá)14 kb的），并且可以用于在溫度高達(dá)65 °C。由于其熱穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄推薦用于富含GC的模板，具有高的二次結(jié)構(gòu)，而不需要包括在反應(yīng)中的添加劑。的試劑盒提供了*鏈cDNA的合成反應(yīng)所需的所有試劑。吸，三個不同的引物系統(tǒng)都可以使用。兩個cDNA合成引物中所提供的試劑盒：隨機(jī)六聚體引物和一個錨定的寡聚（dT）₁₈引物。后者被設(shè)計(jì)成結(jié)合在開始的聚（A）尾產(chǎn)生全長cDNAs和防止從內(nèi)部站點(diǎn)的poly（A）尾的吸。長的mRNA的5'末端的人數(shù)往往不多，因此，該預(yù)充方法對于大多數(shù)應(yīng)用是優(yōu)選的。使用隨機(jī)六聚體引物，使吸統(tǒng)一表示所有RNA序列的RNA的整個長度，并允許不攜帶的poly（A）尾的RNA的逆轉(zhuǎn)錄。耐熱保護(hù)RNase抑制劑包括在套件中，以保護(hù)RNA的在高的反應(yīng)溫度下的降解。




 

逆轉(zhuǎn)錄酶
轉(zhuǎn)錄因子逆轉(zhuǎn)錄-該套件的核心部件-是一個高度敏感的，高耐熱性，重組的逆轉(zhuǎn)錄酶。酶RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性，DNA依賴性DNA聚合酶活性，開卷活性和RNase H活性（降解RNA的RNA：DNA雜交）。后者的活動的存在下，繞過一個額外耗時的核糖核酸酶H孵育步驟反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后的需要。因此，轉(zhuǎn)錄因子的反轉(zhuǎn)錄酶*鏈cDNA合成酶是一種理想的。

可以使用的酶，在溫度高達(dá)65A℃。由于轉(zhuǎn)錄因子逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性，能準(zhǔn)確地抄寫富含GC的模板，有大量的二級結(jié)構(gòu)。此屬性的轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄酶消除了需要特殊的反應(yīng)增強(qiáng)添加劑。

隨機(jī)六聚體引物
的隨機(jī)六聚體引物（包括在試劑盒中）的整個長度，以確保所有的RNA序列的反轉(zhuǎn)錄的RNA的綁定。這些引物也可以不進(jìn)行聚（A）尾巴的RNA的反轉(zhuǎn)錄。

錨定的寡聚（dT）₁₈引物
的錨定的寡聚（dT）₁₈ 引物（試劑盒中包含的）被設(shè)計(jì)為在開頭的poly（A）尾（而非內(nèi)隨機(jī)尾巴）結(jié)合，以產(chǎn)生全長cDNAs 。由于長的mRNA的5'末端中經(jīng)常未被在cDNA的混合物，這對于大多數(shù)應(yīng)用，優(yōu)選引物。

保護(hù)核糖核酸酶抑制劑
耐熱保護(hù)核糖核酸酶抑制劑（包括在套件中）在較高的反應(yīng)溫度保護(hù)RNA的降解。

1. 轉(zhuǎn)錄因子逆轉(zhuǎn)錄酶
2. 轉(zhuǎn)錄因子的RT反應(yīng)緩沖液，5倍濃縮
3. 保護(hù)核糖核酸酶抑制劑
4. dNTP混合液，PCR級
5. 錨定寡（dT）₁₈引物
6. 隨機(jī)六聚體引物 
7. 對照RNA -純化的永生化細(xì)胞系的總RNA組分的K-562。注：  包括僅在50-反應(yīng)包裝大小 
8. 控制PBGD引物組合（正向和反向引物）注：僅包括包裝尺寸在50-反應(yīng) 
9. 水，PCR級

圖1：量化的G6PDH基因的轉(zhuǎn)錄因子的*鏈cDNA合成試劑盒和在LightCycler ^® 2.0儀器。

將不同量的從K-562細(xì)胞的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用隨機(jī)六聚體引物和反應(yīng)條件，電池組中的插入物的概述試劑盒。隨后的PCR為G6PDH基因和在LightCycler ^®快速啟動DNA法師SYBR Green I的試劑盒的特異性引物進(jìn)行藍(lán)色曲線：轉(zhuǎn)錄因子的*鏈cDNA合成試劑盒。紅色曲線： RNA酶H ^-突變體的M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶從供應(yīng)商處A. 轉(zhuǎn)錄因子*鏈cDNA合成試劑盒產(chǎn)生一個更好的形狀，更高的熒光強(qiáng)度，和較低的交叉點(diǎn)的曲線，此外，磷酸葡萄糖脫氫酶基因的表達(dá)模式的一個簡單的分析相比，從供應(yīng)商A的產(chǎn)品的在更寬的線性范圍和動態(tài)檢測范圍是可能的。圖2：定量的H-的HPRT基因與轉(zhuǎn)錄因子的*鏈cDNA合成試劑盒，在LightCycler ^® 480儀器，使用轉(zhuǎn)錄因子的*鏈cDNA合成試劑盒，總RNA反轉(zhuǎn)錄的隨機(jī)六聚體吸100毫微克/ 10皮克/轉(zhuǎn)錄的RNA的反應(yīng)的反應(yīng)使用了在隨后的PCR。在LightCycler ^® 480儀器的使用，重復(fù)18倍的H-HPRT可以檢測到高重現(xiàn)性（三角洲CP從0.29至1.06不等，這取決于對稀釋）。圖3：在兩個轉(zhuǎn)錄因子的*鏈cDNA合成試劑盒的性能步RT-PCR檢測。總RNA反轉(zhuǎn)錄，使用錨定的寡聚（dT）₁₈引物和反應(yīng)條件下的產(chǎn)品的包插入在概述。在隨后的PCR中，使用了5微升cDNA反應(yīng)。30個循環(huán)后，將PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上分離，泳道1，2：起始原料為：人骨骼肌總RNA;片段的擴(kuò)增：肌營養(yǎng)不良蛋白基因，PCR組件：高保真PCR擴(kuò)增系統(tǒng)。泳道3：起始原料為：人力肝臟總RNA片段：載脂蛋白B（Apo B）基因PCR成份：高保真PCR擴(kuò)增系統(tǒng)。弄4：起始材料：人類骨骼肌總RNA片段：抗肌萎縮蛋白基因的PCR組件：高保真PCR擴(kuò)增系統(tǒng)。泳道5 - 9：材料：人類骨骼肌總RNA片段：抗肌萎縮蛋白基因的PCR組件：展開長模板PCR系統(tǒng)。圖4：硼替佐米曝光了廣泛的蛋白酶基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y后表達(dá)的改變。 RNA 200萬個神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì) ??胞分離高純度的RNA提取試劑盒。基因轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄因子的*鏈cDNA合成試劑盒。實(shí)時定量RT-PCR技術(shù)在LightCycler ^® 480儀器使用的LightCycler ^® 480探頭碩士和實(shí)時準(zhǔn)備蛋白酶自定義面板。Cp值的硼替佐米處理的樣品之間的差異和六個控制測定的平均值作圖。使用5個看家基因的Cp值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。酒吧代表SD（n = 6）。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)描 ??述在癌癥研究中的應(yīng)用注釋2。好心提供的，H. BartiJuhász，塞梅爾魏斯大學(xué)，布達(dá)佩斯，匈牙利的數(shù)據(jù)。