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深圳市科潤達生物工程有限公司
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生長激素釋放因子ELISA試劑盒

時間:2012/1/12閱讀:1676
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生長激素釋放因子ELISA試劑盒
(美國DRG*,貨號:EIA3429 )
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預期用途

此試劑盒基于競爭酶免法檢測特異性多肽和相關多肽。
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實驗原理美國DRG中國*代理,。美國DRG中國*代理,。
微孔板預包被有第二抗體,非特異性結合位點封閉,主要抗體的Fab片段競爭結合生物素標記的多肽和標準品或樣本中的目的多肽,二抗則與Fc片段結合。生物素標記的多肽與HRP-鏈霉親和素反應,催化底物反應,黃色強度直接與生物素標記多肽-HRP-鏈霉親和素復合物的量成正比,但是與標準品或樣本中的多肽量成反比。根據已知濃度建立標準曲線,樣本中未知濃度的多肽濃度可直接從標準曲線上讀取。
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試劑盒組成美國DRG中國*代理,。美國DRG中國*代理,。
 

  1. 20X的緩沖濃縮液,50ml
  2. 微孔板,96孔
  3. 封板紙
  4. 主要抗血清,兔抗多肽IgG,1支
  5. 標準品,1支
  6. 生物素標記多肽,1支
  7. HRP-鏈霉親和素,30ul
  8. 陽性質控,2支
  9. 底物液,12ml
  10. 終止液,2N鹽酸,15ml
  11. 坐標紙
  12. 說明書

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實驗所需材料但試劑盒未提供美國DRG中國*代理,。美國DRG中國*代理,。

 

  1. 酶標儀(450nm)
  2. 振蕩器,300-400rpm
  3. 洗板系統
  4. 多通道移液器,50-100ul
  5. 溶液貯存瓶
  6. 吸水紙
  7. 采血管(可選)
  8. 抑肽酶,0.6TIU/ml血液(可選)
  9. 緩沖液A(可選)
  10. 緩沖液B(可選)
  11. C18分離柱

注意:打開試劑和試驗開始前先將其平衡至室溫(20-23℃),強烈建議稀釋過的溶液盡快使用,采血步驟見盒子內的采血說明書,每個盒子所含成分足夠用于96人份檢測或40人份的雙孔檢測。
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實驗步驟美國DRG中國*代理,。美國DRG中國*代理,。
 

  1. 實驗前認真閱讀說明書,所有試劑平衡至室溫(大約25-45min)
  2. 用950ml的去離子水稀釋20X的緩沖濃縮液,得到1X的試驗緩沖液,用于稀釋其他試劑和樣本。注意:如果20X的緩沖液出現了結晶,可在水浴鍋內加熱使其*溶解,使用前*混勻
  3. 用1X的緩沖液稀釋,離心標準品,振蕩。Stock solution的濃度為1000ng/ml,室溫下放置至少10min,至*溶解。使用前離心,振蕩。美國DRG中國*代理,。美國DRG中國*代理,。

標準品準備如下美國DRG中國*代理,。 美國DRG中國*代理,。
編號          標準品的量            緩沖液的量             濃度
Stock           1000ul                ----                    1000ng/ml
#1             100ul的Stock          900ul                  100 ng/ml
#2             100ul的#1             900ul                  10 ng/ml
#3             100ul的#2             900ul                  1ng/ml
#4             100ul的#3             900ul                  0.1 ng/ml
#5             100ul的#4             900ul                  0.01 ng/ml

 

  1. 用5ml的1X的緩沖液稀釋主要抗體,放置至少5min,至*溶解,*混勻
  2. 用5ml的1X的緩沖液稀釋生物素標記多肽,放置至少5min,至*溶解,*混勻
  3. 200ul的1X緩沖液稀釋質控,放置至少5min,至*溶解,*混勻
  4. 將A1和A2孔作為空白對照(Blank
  5. 在B1和B2孔內加50ul的1X緩沖液,作為Total Binding
  6. 將配制好的標準品由#5到#1各50ul依次加入至C1和C2—G1和G2孔內,注意,標準品需做雙份檢測
  7. H1和H2孔加入50ul已稀釋的陽性質控,注意,陽性質控也要做雙孔檢測
  8. 將50ul樣本加入至相應孔內,做雙孔檢測
  9. 除空白孔外(Blank well),每孔加25ul的已稀釋的主要抗體
  10. 除空白孔外(Blank well),每孔加25ul的已稀釋的生物素標記多肽,注意,不建議生物素標記多肽或主要抗血清加樣時使用多通道移液器
  11. 蓋板,室溫,300-400rpm下孵育2小時
  12. 在3000-5000rpm下將HRP-鏈霉親和素離心5秒,然后取12ulSA-HRP和12ul 1X的緩沖液混勻
  13. 移取蓋板,倒去反應液
  14. 每孔350ul 1X緩沖液洗板4次,吸水紙上拍干
  15. 每孔加100ul的SA-HRP
  16. 蓋板,室溫,300-400rpm下孵育1小時
  17. 移取蓋板
  18. 同步驟17)
  19. 每孔加100ul的TMB底物液
  20. 蓋板,室溫,300-400rpm下孵育1小時
  21. 移取蓋板,每孔加100ul的2N 鹽酸終止反應。溶液顏色由藍色變黃色,如未出現統一的顏色變化,用手輕輕拍板,使其*混勻,20分鐘內進行下一步驟
  22. 酶標儀450nm處讀數

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結果計算美國DRG中國*代理,。美國DRG中國*代理,。

在半對數坐標紙上繪制標準曲線。標準品的濃度為X軸,相應的OD值為Y軸,用四參數或對數-對數法繪制zui合適的標準曲線。濃度與OD值成反比關系,隨著標準品濃度的增加,黃色強度就減少,即OD值減少
樣本濃度可直接從標準曲線上讀取。如果樣本實驗前進行了稀釋,則zui后結果應乘以相應的稀釋因子
標準曲線為逆向S型曲線美國DRG中國*代理,。 美國DRG中國*代理,。
 
附:采用全自動酶標儀檢測,只需檢測前設置好酶標儀的相關參數,如坐標參數(線性,半對數)和計算方式參數(三次回歸、四參數或雙對數曲線方程),即可直接得到結果。美國DRG中國*代理,。
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貯存美國DRG中國*代理,。美國DRG中國*代理,。
 

  1. 收到貨后貯存于4℃
  2. 強烈建議盡快使用配制的試劑
  3. 1X緩沖液貯存于4℃
  4. 將不用的微孔板放回至密封袋內密封起來,貯存于4℃
  5. 已稀釋的標準品,生物標記物,抗體和HRP貯存于4℃

樣本采集的建議美國DRG中國*代理,。美國DRG中國*代理,。
血液采集美國DRG中國*代理,。美國DRG中國*代理,。
用含有EDTA的采血管采集血液,每管可裝7ml,采到了抗凝血液后立即搖晃幾次,將血液從采血管轉至含抑肽酶的離心管,不斷搖晃,抑制蛋白酶活性,1600xg轉速,4℃下離心15min,,收集血漿,血漿樣本可在-70℃下保存1個月。如果采血管可用于離心,可直接將抑肽酶加入至采血管內。美國DRG中國*代理,。
血漿中提取多肽美國DRG中國*代理,。美國DRG中國*代理,。
 

  1. 用等量的緩沖液A酸化血漿,如1ml的血漿加入1ml的緩沖液A,混勻,6000-17000xg下,4℃離心20min
  2. 分離柱內含200mg的C18,依次用緩沖液A(3ml ,3次)和緩沖液B(1ml,1次),使其平衡

注意:步驟3-5中不能對分離柱施加任何壓力
 

  1. 將酸化的血漿倒入至預平衡的C18分離柱內
  2. 用緩沖液A(3ml,2次)慢慢洗柱,倒去洗液
  3. 用緩沖液B(3ml,1次)慢慢洗提多肽,收集至塑料管內
  4. 用離心濃縮機或其他方法將洗提液蒸干
  5. 將抽提物直接貯存于-20℃,并盡快進行試驗,用1X的緩沖液直接配制。如果多肽濃度不在檢測范圍內,就直接進行稀釋或濃縮

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中國*總代理:深圳市科潤達生物工程有限公司
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技術咨詢 :,;手機,;,kerunda@szonline.net
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