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首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)，其次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配) ，再次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。引物設(shè)計(jì)應(yīng)注意如下要點(diǎn)：
1.引物的長(zhǎng)度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp。
2.引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3’端出現(xiàn)3 個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG 或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。
3.引物3’端的末位堿基對(duì)Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A 的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A。
4.引物序列的GC 含量一般為40-60%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5.引物的另一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度(Tm)。這是當(dāng)50%的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度。合理的退火溫度從55℃到70℃。為獲得*結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的Tm值。
6.引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR 反應(yīng)失敗。應(yīng)該盡量避免。