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酶標記抗體法的實驗原理總體來說和熒光素標記抗體法的原理類似，分為直接法和間接法，其原理基本相同，但敏感性不同。
一、直接法
直接法是將酶（如HRP）標記在特異性抗體（*抗體）上，然后用酶標記抗體直接與相應原特異性結合，形成抗原—抗體—HRP復合物，然后后用酶底物DAB-H202顯色。該法的優點是簡單、步驟少，省時、特異性高、非特異性染色輕：缺點是敏感性差，因為一個抗原決定簇只結合一個HRP分子（假設一個抗體分子與一個HRP分子結合）。另外，一種標記抗體也只能檢測一種抗原。若要檢測多種抗原，就必須標記每一種特異抗體，這樣既麻煩又不經濟。目前此法很少應用，但在單克隆抗體制備過程中，為了更特異地篩選單抗，仍常用此法。
二、間接法
間接法也稱夾心法，是直接法的簡單改進，將酶示蹤物標記在二抗上，再與*抗體（已與相應抗原反應形成復合物的IgG）反應，然后進行顯色反應。此法要求第二抗體與特異性抗體（一抗）應是不同種屬的動物產生，如特異性抗體（一抗）是兔抗人IgG，酶標記抗體（二抗）則可以是羊抗兔抗體。
間接法與直接法比較有以下優點：
1、應用面較寬，僅標記一種二抗就可以檢測眾多相同的*抗體，例如眾多一抗為兔來源，只要標記一種抗兔二抗就可用于所有抗兔一抗的檢測，不需要對每種特異性抗體進行標記；
2、敏感性增加，*抗體的工作濃度在直接法的基礎上進一步稀釋；
3、可以商品化購置；
4、可以設計各種對照。
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