16
進行超薄切片前需要進行哪些工作
由于電鏡產(chǎn)生的電子束穿透能力很弱，必須把標本切成厚度小于0.1um以下的薄片才能適用，這種薄片稱為超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。
在透射電鏡的樣品制備方法中，超薄切片技術是最基本、最常的制備技術。超薄切片的制作過程基本上和石蠟切片相似
超薄切片前的準備工作
1.修塊
一般用手工對包埋塊進行修整。將包埋塊夾在特制的夾持器上，放在解剖顯微鏡下，用鋒利的刀片先削去表面的包埋劑，露出組織，然后在組織的四周以和水平面成45度的角度削去包埋劑，修成錐體形。
2.半薄切片定位
利用超薄切片機切厚度為1μm-5μm的切片，稱半薄切片。將切下的片子用鑷子或小毛刷轉(zhuǎn)移到干凈的事先滴有蒸餾水的載玻片上，加溫，使切片展平，干燥后經(jīng)甲苯胺藍染色，光學顯微鏡觀察定位。如果半薄切片做得好，比一般石蠟切片更能觀察到細微結構，效果比石蠟切片要好一些。
半薄切片進行光學顯微鏡觀察的目的：(1) 定位：通過光學顯微鏡觀察，確定所要觀察的范圍，然后保留要用電鏡觀察的部分，修去其余部分。(2)便于對同一組織的同一部位進行光學顯微鏡和電鏡的對比觀察。半薄切片定位以后，要對包埋塊作進一步的修整。通常將塊的頂端修成金字塔形，頂面修成梯形或長方形(最好是梯形)，每邊的長度為0.2mm～0.3mm。
3.制刀
超薄切片使用的刀有兩種：一種是玻璃刀，另一種是鉆石刀。由于玻璃刀價格便宜，使用者較多。制刀用的玻璃為硬質(zhì)玻璃，有一定的規(guī)格，厚度為5mm～6.5mm。
玻璃刀用專用制刀機制作。制好玻璃刀后，要圍繞刀口制作一只水槽，以便使超薄切片漂浮在水面上。水槽有樹膠水槽和膠布水槽兩種。樹膠水槽有固定的形狀，可反復使用。膠布水槽是臨時用膠布或?qū)Ｓ盟芰蠗l制作的。裝好水槽后，用熔化的石蠟封固接口，防止漏水。
4.載網(wǎng)和支持膜
4.1 載網(wǎng)
電鏡中使用的載網(wǎng)有銅網(wǎng)、不銹鋼網(wǎng)、鎳網(wǎng)等，一般常用銅網(wǎng)。載網(wǎng)為圓形，直徑3mm。網(wǎng)孔的形狀有圓形、方形、單孔形等。
網(wǎng)孔的數(shù)目不等，有100、200、300目等多種規(guī)格，可根據(jù)需要進行選擇。
4.2 支持膜的制備
挑選并清洗好載網(wǎng)之后，要在載網(wǎng)上覆蓋一層薄膜，這層薄膜稱支持膜，厚度為10nm～20nm。對支持膜的要求是透明無結構，并能承受電子束的轟擊。常用的支持膜有火棉膠膜及聚乙烯醇縮甲醛膜(Formvar膜)，一般采用后者。
超薄切片
超薄切片需用超薄切片機進行。根據(jù)推進原理不同，將超薄切片機分為兩大類：一類是機械推進式切片機，用微動螺旋和微動杠桿來提供微小推進；另一類是熱脹冷縮式切片機，利用金屬桿熱脹或冷縮時產(chǎn)生的微小長度變化來提供推進。
超薄切片的步驟包括：(1)安裝包埋塊；(2)安裝玻璃刀；(3)調(diào)節(jié)刀與組織塊的距離；(4)調(diào)節(jié)水槽液面高度與燈光位置；(5)調(diào)節(jié)加熱電流及切片速度，切片；(6)將切片撈在有支持膜的載網(wǎng)上。