對小鼠整個視網膜進行快速、清晰的高對比度成像，以研究內皮細胞、血管、小膠質細胞和星形膠質細胞之間的相互作用。
本文描述通過使用THUNDER Imager 3D Cell Culture和Large Volume Computational Clearing（LVCC）技術高效地研究小鼠視網膜中內皮細胞、血管、小膠質細胞和星形膠質細胞之間的相互作用。視網膜血管疾病一般是視力受損的主要原因。基因突變會導致人體視網膜血管發生改變，進而引發家族性滲出性玻璃體視網膜病變（FEVR）、諾里病、早產兒視網膜病變（ROP）或Coats病。
視網膜中內皮細胞、血管、小膠質細胞和星形膠質細胞之間的相互作用可使用小鼠視網膜模型來進行研究。通過整個視網膜制樣和高分辨率熒光成像可觀察視網膜血管網絡和細胞相互作用的信息。
簡介
視網膜血管疾病是導致視力受損和失明的主因[1]。大多數哺乳動物的視網膜由三層血管網絡形成，其中包括兩個視網膜內毛細血管床。在人體內，基因突變會引發家族性滲出性玻璃體視網膜病變（FEVR）、以及周邊視網膜血管化不完整為特征的遺傳性疾病、如諾里病、早產兒視網膜病變（ROP）或Coats病[1]?；加羞@些疾病的視網膜血管都有所改變?？茖W家利用小鼠視網膜模型來研究視網膜中內皮細胞、血管、小膠質細胞和星形膠質細胞間的相互作用。利用整個視網膜制片來展示視網膜血管[1]。固定并染色后，必須對整個視網膜進行高分辨率成像，以觀察整個血管網絡及單細胞相互作用。本文將展示如何使用THUNDER Imager 3D Cell Culture和Large Volume Computational Clearing（LVCC）高效地研究小鼠視網膜細胞間的相互作用[2，3]。
挑戰
如何對整個視網膜進行快速成像，并獲得清晰的高對比度3D成像結果，展示重要細節對研究視網膜至關重要。視網膜成像一般使用共聚焦顯微鏡進行掃描，但是這種方法要花費數小時才能采集到整個視網膜圖像。而常規的寬場顯微雖然成像速度快，檢測靈敏度高，但是對厚標本的成像，如整個視網膜，通常會出現非焦平面干擾導致模糊，降低對比度[2，3]。
方法
使用THUNDER Imager 3D Cell Culture儀器對整個視網膜進行成像。使用抗CD31抗體標記視網膜內皮細胞（黃色），使用IsoB4標記視網膜血管和小膠質細胞（品紅色），并使用抗GFAP抗體標記星形膠質細胞（青色）。觀察整個視網膜時，采用3個熒光通道，用20x Plan Apo 0.8 NA（數值孔徑）物鏡和100個視野拼接、厚度為15-μm進行 Z軸堆棧成像。
結果
Large Volume Computational Clearing（LVCC）[2，3]方法可清晰展示視網膜內的內皮細胞、小膠質細胞和星形細胞間的相互作用（見圖1）。一般情況下，通過寬場顯微鏡很難觀察到視網膜中的這些細胞。通過THUNDER Imager 3D Cell Culture進行高速采集，可在幾分鐘時間內采集到大約24 GB的整個視網膜成像。采用LAS X Navigator軟件中焦平面矯正的方法，可以保證視網膜樣本每一個位置都處于最佳焦平面。
圖1：使用THUNDER Imager 3D Cell Culture整個視網膜制片的zui大化投影圖像：A) 寬場原始數據和 B) LVCC結果。插圖所示為單個內皮細胞（黃色， CD31抗體）、血管和小膠質細胞（品紅色，IsoB4）和星形細胞（青色， GFAP抗體）的寬場視圖。圖片來源：Jiyeon Lee博士和Jeremy Burton博士，Roche Genentech，美國加利福尼亞州南舊金山。
結論
THUNDER Large Volume Computational Clearing（LVCC）[2，3]與傳統寬場成像相比，對整個小鼠視網膜成像時會顯著增強對比度，可以高效地研究內皮細胞、血管、小膠質細胞和星形細胞間的相互作用。
References：
1.H.J. Junge, S. Yang, J.B. Burton, K. Paes, X. Shu, D.M. French, M. Costa, D.S. Rice, W. Ye, TSPAN12 Regulates Retinal Vascular Development by Promoting Norrin- but Not Wnt-Induced FZD4/β-Catenin Signaling, Cell (2009) vol. 139, iss. 2, pp. 299-311, DOI: 10.1016/j.cell.2009.07.048.
2.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note: THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.
3.L. Felts, V. Kohli, J.M. Marr, J. Schumacher, O. Schlicker, An Introduction to Computational Clearing: A New Method to Remove Out-of-Focus Blur, Science Lab (2020) Leica Microsystems.
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