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瓊脂糖凝膠電泳
點(diǎn)擊次數(shù)：2413 發(fā)布時(shí)間：2016-4-26
瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DN段的常用方法。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動(dòng)。不同濃度瓊脂糖凝膠可以分離從200bp至50kb的DN段。在瓊脂糖溶液中加入低濃度的溴化乙錠（ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以檢出 10ng的DNA條帶，在電場(chǎng)中，pH8.0條件下，凝膠中帶負(fù)電荷的DNA向陽(yáng)極遷移。
瓊脂糖凝膠有如下特點(diǎn)：
（1）DNA的分子大小 在凝膠基質(zhì)中其遷移速率與堿基對(duì)數(shù)目的常用對(duì)數(shù)值成反比，分子越大遷移得越慢。
（2）瓊脂糖濃度 一個(gè)特定大小的線形DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率（u）的對(duì)數(shù)與凝膠濃度（t）成線性關(guān)系。
（3）電壓 低電壓時(shí)，線狀DN段遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，不同分子量DN段的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng)，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DN段的分辨率達(dá)到，所加電壓不得超過(guò)5v/cm。
（4）電泳溫度 DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的電泳行為受電泳時(shí)的溫度影響不明顯，不同大小的DN段其相對(duì)遷移速率在4℃與30℃之間不發(fā)生明顯改變，但濃度低于0.5%的凝膠或低熔點(diǎn)凝膠較為脆弱，在4℃條件下電泳。
（5）嵌入染料 熒光染料溴化乙錠用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的DNA，染料嵌入到堆積的堿基對(duì)間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA,使其剛性更強(qiáng),還會(huì)使線狀遷移率降低15%。
（6）離子強(qiáng)度 電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA電泳遷移率。在沒(méi)有離子存在時(shí)（如誤用蒸餾水配制凝膠，電導(dǎo)率zui小，DNA幾乎不移動(dòng)，在高離子強(qiáng)度的緩沖液中（如誤加10×電泳緩沖液），則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化。
對(duì)于天然的雙鏈，常用的幾種電泳緩沖液有TAE、TBE等，一般配制成濃縮母液，室溫保存，用時(shí)稀釋。