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細胞培養常見問題

　1.冷凍管應如何解凍？
　　
　　取出冷凍管后，須立即放入37°C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂。
　　
　 2.細胞冷凍管解凍培養時，是否應馬上去除DMSO？
　　
　　除少數特別注明對DMSO敏感之細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后，應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中，待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。
　　
　　3.可否使用與原先培養條件不同之培養基？
　　
　　不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基，若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基，細胞大都無法立即適應，造成細胞無法存活。
　　
　　4.可否使用與原先培養條件不同之血清種類？
　　 不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。
　　
　　5.何謂FBS,FCS,CS,HS?
　　 FBS（fetalbovineserum）和FCS（fetalcalfserum）是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，FCS乃錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS（calfserum）則是指小牛血清。HS（horseserum）則是指馬血清。
　　
　　6.培養細胞時應使用5%或10%CO2？或根本沒有影響？
　　
　 　一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統，而培養基中NaHCO3的含量將決定細胞培養時應使用的CO2濃度。當培養基中 NaHCO3含量為每公升3.7g時，細胞培養時應使用10%CO2；當培養基中NaHCO3為每公升1.5g時，則應使用5%CO2培養細胞。
　　
　　7.何時須更換培養基？
　　
　　視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數據上之更換時間，按時更換培養基即可。
　　
　　8.培養基中是否須添加抗生素？除于特殊篩選系統中外，一般正常培養狀態下，培養基中不應添加任何抗生素。
　　
　　9.附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA濃度？應如何處理？
　　
　　一般使用之trypsin-EDTA濃度為0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20°C，避免反復冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機會。
　　
　　10.懸浮性細胞應如何繼代處理？
　　
　　一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中，稀釋細胞濃度即可，若培養液太多時，可將培養角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶，加入新鮮培養基稀釋至適當濃度，重復前述步驟即可。
　　
　　11.欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？
　　
　　欲回收動物細胞，其離心速率一般為300xg（約1,000rpm），5-10分鐘，過高之轉速，將造成細胞死亡。
　　
　　12.細胞之接種密度為何？依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。
　　
　　13.細胞冷凍培養基之成份為何？
　　
　　動物細胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養基是含5-10%DMSO（dimethylsulfoxide）和90-95%原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意：由于DMSO稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。
　　
　　14.DMSO之等級和無菌過濾之方式為何？
　　
　 　冷凍保存使用之DMSO等級，必須為Tissueculturegrade之DMSO（如SigmaD2650），其本身即為無菌狀況，次開瓶后應立即 少量分裝于無菌試管中，保存于4°C，避免反復冷凍解凍造成DMSO之裂解而釋出有害物質，并可減少污染之機會。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO之 Nylon材質濾膜。
　　
　　15.冷凍保存細胞之方法？
　　

  冷凍保存方法一:冷凍管置于4°C30~60分鐘→（-20°C30分鐘*）→-80°C16~18小時（或隔夜）→液氮槽vaporphase長期儲存。
　　

  冷凍保存方法二:冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3°C至–80°C以下，再放入液氮槽vaporphase長期儲存。*-20°C不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
　　
　　16.細胞欲冷凍保存時，細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？
　　
　　冷凍管內細胞數目一般為1x106cells/mlvial，融合瘤細胞則以5x106cells/mlvial為宜。
　　
　　17.應如何避免細胞污染？細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之方法。
　　
　　18.如果細胞發生微生物污染時，應如何處理？
　　
　　直接滅菌后丟棄之。
　　
　　19.支原體（mycoplasma）污染的細胞，是否能以肉眼觀察出異狀？
　　
　　不能。除極有經驗之專家外，大多數遭受支原體污染的細胞株，
　　
　　無法以其外觀分辨之。
　　
　　20.支原體污染會對細胞培養有何影響？
　　
　　支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數，代謝及研究之任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數據方有意義。
　　
　　21.偵測出細胞株有支原體污染時，該如何處理？
　　
　　直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。
　　
　　22.CO2培養箱之水盤如何保持清潔？
　　
　　定期（至少每兩周一次）以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。
　　
　　23.為何培養基保存于4°C冰箱中，顏色會偏暗紅色，且pH值會越來越偏堿性？
　　
　　培養基保存于4°C冰箱中，培養基內之CO2會逐漸溢出，造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑（通常為phenolred）的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果，將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時，可以通入無菌過濾之CO2，以調整pH值。
　　
　　24.各種細胞培養用的dish，flask是否均相同？
　　
　　不同廠牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，雖對大部分細胞沒有太大之影響，惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish或flask而有顯著之生長差異。
　　
　　25.購買之細胞冷凍管經解凍后，為何會發生細胞數目太少之情形？
　　
　　研究人員在冷凍細胞之培養時出現細胞數目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。
　　
　　26.購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？
　　
　　研究人員在細胞培養時出現存活率不佳，常見原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80°C太久。
　　
　　27.收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？
　　
　　冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應立刻將冷凍管再一次扭緊.