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技術文章
流式細胞實驗常見問題解答
點擊次數：3584 發布時間：2011-12-21
流式細胞術常見問題解答
BioLegend公司提供了哪些熒光標記抗體？
答：BioLegend公司提供APC、APC/Cy7、Alexa FluorTM 488、Alexa FluorTM 647、Alexa FluorTM 700、Biotin、Brilliant VioletTM 421、FITC、DyLightTM 594、DyLightTM 649、Pacific BlueTM、PE、PE/Cy5、PE/Cy7、PerCP、PerCP/Cy5.5共計16種熒光素標記的7000多種流式抗體供客戶選擇。
流式細胞實驗的對照應該如何設置？什么是同型對照？
答：①在應用流式技術檢測細胞表面抗原時，我們通常要設的一個對照就是同型對照。
同型對照：使用與熒光標記抗體相同來源、相同標記、相同劑量和亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面而產生的背景染色。
②細胞因子的流式檢測時，由于細胞經過了培養刺激活化的處理，為保證測得結果的準確性和客觀性，除了同型對照外，還需另設置未刺激對照和刺激對照。
未刺激對照：激活時由于BFA等的存在抑制了胞內蛋白的轉運，因此在激活過程中產生的抗原與細胞因子會滯留胞內，未刺激對照也應包含BFA等阻斷劑。
激活對照：激活對照使用細胞表面表達CD69來評價激活與否，如果未達到CD69期望的水平，則激活步驟出了問題，某一試劑可能失活，過期，制備不當或溶劑污染，需制備新鮮刺激劑重新實驗。
答：①在應用流式技術檢測細胞表面抗原時，我們通常要設的一個對照就是同型對照。
同型對照：使用與熒光標記抗體相同來源、相同標記、相同劑量和亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面而產生的背景染色。
②細胞因子的流式檢測時，由于細胞經過了培養刺激活化的處理，為保證測得結果的準確性和客觀性，除了同型對照外，還需另設置未刺激對照和刺激對照。
未刺激對照：激活時由于BFA等的存在抑制了胞內蛋白的轉運，因此在激活過程中產生的抗原與細胞因子會滯留胞內，未刺激對照也應包含BFA等阻斷劑。
激活對照：激活對照使用細胞表面表達CD69來評價激活與否，如果未達到CD69期望的水平，則激活步驟出了問題，某一試劑可能失活，過期，制備不當或溶劑污染，需制備新鮮刺激劑重新實驗。
間接免疫熒光標記法如何設置同型對照？
答：同型對照的目的是消除由于抗體非特異性結合到細胞表面而產生的背景染色，而確保檢測結果的真實性。在采用間接免疫熒光標記法流式檢測時，所設的同型對照是與一抗相同劑量、相同亞型和相同生物素標記（或純化）免疫球蛋白，之后的熒光標記過程與實驗檢測組相同即可。BioLegend公司提供了各色標記和純化的同型對照免疫球蛋白。
答：同型對照的目的是消除由于抗體非特異性結合到細胞表面而產生的背景染色，而確保檢測結果的真實性。在采用間接免疫熒光標記法流式檢測時，所設的同型對照是與一抗相同劑量、相同亞型和相同生物素標記（或純化）免疫球蛋白，之后的熒光標記過程與實驗檢測組相同即可。BioLegend公司提供了各色標記和純化的同型對照免疫球蛋白。
為什么流式細胞術多色分析時要進行熒光補償調整？
答：在進行流式細胞術多色分析時,待測細胞通常攜帶兩種或兩種以上的熒光素,如異硫氰熒光素（FITC）、藻紅蛋白（PE）、別藻紅蛋白（PECY5）等。這些熒光素被激光激發后發出不同波長的熒光,理論上每一種熒光通過選擇恰當的濾光片可被相應的檢測器檢測到,而不受其他熒光的干擾。但目前這些熒光染料都具有寬發射譜性質,盡管它們的發射峰各不相同,但發射譜范圍有一定的重疊,也就是說,相鄰的檢測器會檢測到彼此的熒光信號,例如,FITC檢測器會檢測到少量的PE光譜,而PE檢測器會檢測到較多的FITC光譜。這樣就影響了檢測結果的準確性,因此,多色分析時必須進行光譜重疊的校正。
答：在進行流式細胞術多色分析時,待測細胞通常攜帶兩種或兩種以上的熒光素,如異硫氰熒光素（FITC）、藻紅蛋白（PE）、別藻紅蛋白（PECY5）等。這些熒光素被激光激發后發出不同波長的熒光,理論上每一種熒光通過選擇恰當的濾光片可被相應的檢測器檢測到,而不受其他熒光的干擾。但目前這些熒光染料都具有寬發射譜性質,盡管它們的發射峰各不相同,但發射譜范圍有一定的重疊,也就是說,相鄰的檢測器會檢測到彼此的熒光信號,例如,FITC檢測器會檢測到少量的PE光譜,而PE檢測器會檢測到較多的FITC光譜。這樣就影響了檢測結果的準確性,因此,多色分析時必須進行光譜重疊的校正。
如何檢測胞內因子抗體的特異性？
答：可以應用過量的相應細胞因子先封閉該胞內因子的熒光標記抗體，或者先用不帶熒光標記的相應因子抗體先封閉細胞，進一步流式操作作對照；另外同型對照也可以判斷細胞的固定、破膜的效果以及非特異性背景的影響。
答：可以應用過量的相應細胞因子先封閉該胞內因子的熒光標記抗體，或者先用不帶熒光標記的相應因子抗體先封閉細胞，進一步流式操作作對照；另外同型對照也可以判斷細胞的固定、破膜的效果以及非特異性背景的影響。
為什么用CD45αSSC設門法進行流式細胞術白血病表型分析？
答:免疫分型所用的樣本通常是骨髓,由于骨髓中各種大小和分化程度的細胞均有,只根據細胞大小和顆粒密度很難將不同組分的細胞區分開。而造血系統細胞的CD45表達的熒光強度（FI）與細胞分化程度有一定關系,即分化程度高的成熟白細胞其CD45的FI也高,分化程度低的細胞其FI也低,而紅系細胞的FIzui低。在成熟白細胞中,各類細胞其CD45的FI亦不相同,其中淋巴細胞和單核細胞的FI高于中性粒細胞。因此,根據各類細胞CD45的FI和顆粒密度不同,采用CD452SSC（側向角散射）設門法可以將原始細胞（低FI,低或高SSC）、淋巴細胞（高FI,低SSC）、單核細胞（高FI,中等SSC）、中性粒細胞（低FI,高SSC）、紅系細胞（zui低FI,低或高SSC）和細胞碎片（zui低FI,zui低SSC）清楚地區分開。
答:免疫分型所用的樣本通常是骨髓,由于骨髓中各種大小和分化程度的細胞均有,只根據細胞大小和顆粒密度很難將不同組分的細胞區分開。而造血系統細胞的CD45表達的熒光強度（FI）與細胞分化程度有一定關系,即分化程度高的成熟白細胞其CD45的FI也高,分化程度低的細胞其FI也低,而紅系細胞的FIzui低。在成熟白細胞中,各類細胞其CD45的FI亦不相同,其中淋巴細胞和單核細胞的FI高于中性粒細胞。因此,根據各類細胞CD45的FI和顆粒密度不同,采用CD452SSC（側向角散射）設門法可以將原始細胞（低FI,低或高SSC）、淋巴細胞（高FI,低SSC）、單核細胞（高FI,中等SSC）、中性粒細胞（低FI,高SSC）、紅系細胞（zui低FI,低或高SSC）和細胞碎片（zui低FI,zui低SSC）清楚地區分開。