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免疫組化抗體選擇及常用染色方法
點擊次數：4447 發布時間：2011-9-21
免疫組化抗體選擇及常用染色方法
一、免疫組織化學（Immunohistochemistry,IHC）
免疫組織化學是利用抗原抗體的特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑 （熒光素、酶、金屬離子、同位素） 顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究。免疫組織化學染色技術不僅有較高的敏感性和特異性，其特點是將形態學改變與功能、代謝變化結合起來，直接在組織切片，細胞涂片或培養細胞爬片上定位一些蛋白質和多肽類物質的存在，并可到亞細胞結構水平，結合電子計算機圖像分析系統或激光掃描共聚集顯微術等技術，對被檢物質進行定量分析。
免疫組化實驗所用的組織和細胞標本有哪些？
實驗所用主要為組織標本和細胞標本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細胞爬片和細胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標本zui常用、zui基本的方法，對于組織形態保存好，且能作連續切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復，是免疫組化中的組織標本制作方法。
石蠟切片為什么要做抗原修復？有哪些方法？
石蠟切片標本均用甲醛固定，使得細胞內抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時蛋白之間發生交聯而使抗原決定簇隱蔽。所以要求在進行IHC染色時，需要先進行抗原修復或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯破壞，而恢復抗原的原有空間形態。
常用的抗原修復方法有微波修復法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復液是pH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。
1、一抗選擇要點
（1）選擇單克隆還是多克隆抗體。由一種克隆產生的特異性抗體叫做單克隆抗體，單克隆抗體能目標明確地與單一特異抗原決定簇結合，就象導彈地命中目標一樣。另一方面，即使是同一個抗原決定簇，在機體內也可以由好幾種克隆產生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應中，一般單克隆抗體特異性強，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對較低；而多克隆抗體特異性稍弱，抗體的親和力強，靈敏度高，但易出現非特異性染色（可以通過封閉等有所避免）。
（2）種屬來源。一般家兔來源的抗體多是多克隆；而小鼠來源的抗體多是單克隆，但也有另外。這條主要要與后面的二抗來源相匹配。
（3）實驗目的是檢測什么種屬的抗原，即species reactivity。這一點很重要，一般說明書上都有注明，如小鼠Ms、大鼠Rat、人Hum等等。
（4）能否做免疫組化。一般一抗說明書都會注明做WB、IHC、ICC、IF等，建議選擇注明的抗體，因為一般都是經過文章證明。
（5）檢測標本類型。用于檢測石蠟切片還是冰凍切片，一般能做石蠟切片的抗體，可能都可以用來檢測冰凍切片，但能做冰凍切片的抗體，不一定能檢測石蠟切片中的抗原。
（6）生產廠家。國外抗體生產商原裝抗體質量一般沒問題，尤其是美國Lifespan公司生產的IHCPlusAntibodies系列抗體，全部經過病理組織切片檢測驗證，100%質量保證，國內北京西美杰科技有限公司有售，就是價格有點貴；而國內分裝廠家用的一抗工作液，價格便宜，但有時結果的穩定性和重復性稍差，不同批次重復性較差。
（7）價格與質量的矛盾。我個人認為一抗原裝質量可能會好點，因為許多一抗避免反復凍融，且在稀釋液中穩定性較差（若時間長），但價格較貴。
（1）種屬來源。主要根據一抗種屬來源來決定購買二抗來源，如一抗是小鼠來源，那二抗就買抗小鼠的即可（羊、兔等均可）。
（2）標記物的選擇。有HRP、Biotin、熒光素等標記物。一般SP三步法二抗選擇Biotin標記的二抗，以與后面的SP結合反應；而免疫熒光染色就需要購買不同熒光素標記的二抗，如羅丹明、FITC、Cy3等常用熒光素。這主要與后面有無三抗和三抗種類有關。
（3）選擇IgM還是IgG。一般一抗是IgM，那么二抗就選擇IgM；反之，一抗是IgG，則二抗選擇IgG。
（4）生產廠家。一般SP三步法我們實驗室選擇中杉金橋的二抗染色試劑盒，內含有工作液的二抗，故試驗中只需摸索一抗的濃度即可，效果還可以；而免疫熒光的二抗我一般選擇Jackson ImmnoResearch公司，效果還不錯。
根據標記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標法，親和組織化學法，后者是以一種物質對某種組織成分具有高度親合力為基礎的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗體）在細胞或亞細胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法zui常用。
免疫組織化學染色方法 IHC染色方法有很多種，按部標記物的性質可分為熒光法（熒光素標記），酶法（辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶），免疫金銀及鐵標記技術等;按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步，三步或多步法）;按結合方式可分為抗原-抗體結合，如PAP法和標記的葡聚糖聚合物（labeled dextran polymer,LDP）法，以及親和連接，如ABC法、標記的鏈親和素-生物素（labeled streptoavidin-biotin ,LSAB）法等，其中LSAB是zui常用的使用方法。
影響免疫組化染色質量的因素很多，在實驗中應注意組織的取材和固定，選擇質量好的商品化抗體，恰當的選擇和使用封閉和抗原修復手段，嚴格的技術操作和對照等。由于組織內待測抗原已被分解破壞，或抗原含量過低、或固定劑的使用不當及抗體質量不佳和稀釋度不當等可出現假陰性反應;反之，由于抗體與非待檢抗原發生交叉反應，或組織對抗體的非特異性吸附及內源性過氧化酶（endogenousperoxidase）沒有被阻斷等還可出現假陽性結果。這些可造成判斷的失誤。