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技術文章
免疫組化技術要點和常見問題
點擊次數：3438 發布時間：2010-12-27
免疫組化技術要點和常見問題
在免疫組化過程中，為了更好的說明問題和查找原因，設置陽性對照片（已知的高表達相應抗原的組織）和陰性對照組織片（不加一抗但是加二抗系統/不加任何抗體兩組），所有操作過程應*一致。
染色弱或者沒有染色（按照先后順序，先排除一些簡單的原因）：
試劑使用順序錯誤或者漏加試劑重復實驗，保證每一步均正確
二抗和一抗不匹配選擇匹配的二抗
底物和酶不匹配選用匹配的底物
酶失活換用新的酶（將酶和底物混合，看是否顯色？）
組織中沒有待測抗原表達或者表達水平低使用陽性對照片
抗體濃度太低增加抗體濃度.使用不同濃度的抗體，決定*濃度
抗體孵育時間不充分延長抗體孵育時間
底物孵育不充分延長底物孵育時間
抗體儲存不當，導致失效將抗體分裝，低溫保存 （-20 to -70 C） ，避免反復凍溶。稀釋抗體在4保存1-2周，避免時間過長。或者根據說明書進行恰當的保存
一抗失效換用新的一抗
二抗失效換用新的抗體（能否成功與其它一抗配合？）
脫石臘不充分延長脫臘時間或者換用新的二甲苯
組織固定不充分或者不當增加固定時間或者改用不同的固定方法
組織固定過度減少固定時間。若已固定過度，則需使用正確的或者推薦的抗原修復方法
復染試劑與底物系統不匹配選擇正確的復染試劑（不加復染劑，看是否有組織染色？）
封片劑不正確選擇正確的封片劑
染色背景高：
可能原因解決辦法
洗片不充分每步之間至少洗片3次
組織含有內源性的酶，如HRP/AP在加入一抗之前使用3％的H2O2甲醇封閉內源性HRP活性，使用左旋咪唑（levamisole）溶液阻斷內源性AP活性。或者換用葡萄糖氧化酶系統
組織含有內源性生物素（尤其是腎臟、肝和脾）在加入一抗之前，血清封閉之后使用avidin/biotin阻斷試劑。或者避免使用biotin-avidin系統或改用IF方法（直接將酶和底物加到組織片上，看是否顯色？）
一抗的非特異性結合或者抗體濃度過高增加一抗的稀釋度
二抗和組織非特異性結合使用與二抗來源相同的正常動物血清（一般是10％）封閉，必要時可以將血清濃度加大
組織固定不充分，抗原擴散Increase duration of postfixation
使用小鼠來源的二抗檢測小鼠組織在加一抗之前使用MouseOnMouse封閉試劑
干片染色過程中避免出現干片現象
可能原因解決辦法
洗片不充分每步之間至少洗片3次
組織含有內源性的酶，如HRP/AP在加入一抗之前使用3％的H2O2甲醇封閉內源性HRP活性，使用左旋咪唑（levamisole）溶液阻斷內源性AP活性。或者換用葡萄糖氧化酶系統
組織含有內源性生物素（尤其是腎臟、肝和脾）在加入一抗之前，血清封閉之后使用avidin/biotin阻斷試劑。或者避免使用biotin-avidin系統或改用IF方法（直接將酶和底物加到組織片上，看是否顯色？）
一抗的非特異性結合或者抗體濃度過高增加一抗的稀釋度
二抗和組織非特異性結合使用與二抗來源相同的正常動物血清（一般是10％）封閉，必要時可以將血清濃度加大
組織固定不充分，抗原擴散Increase duration of postfixation
使用小鼠來源的二抗檢測小鼠組織在加一抗之前使用MouseOnMouse封閉試劑
干片染色過程中避免出現干片現象
染色強度過大：
可能原因 解決辦法
一抗或者二抗濃度過高降低抗體濃度。或者使用不同的濃度，決定*染色濃度
孵育時間過長減少孵育時間
孵育溫度太高降低孵育溫度，在4℃過夜或者37℃0.5-1小時或者RT
底物孵育時間過長減少孵育時間
干片染色過程中避免出現干片現象
可能原因 解決辦法
一抗或者二抗濃度過高降低抗體濃度。或者使用不同的濃度，決定*染色濃度
孵育時間過長減少孵育時間
孵育溫度太高降低孵育溫度，在4℃過夜或者37℃0.5-1小時或者RT
底物孵育時間過長減少孵育時間
干片染色過程中避免出現干片現象