一、DNA 的片段化

典型的細(xì)胞凋亡以細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)DNA的特征性片段化為主要特征。細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活DNA雙鏈被切成特征性的片段。

二、內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活及其作用

早在20世紀(jì)70年代就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在正常細(xì)胞中存在對(duì)Ca2+和 Mg2+依賴(lài)的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶，這種Ca2+、Mg2+依賴(lài)性核酸內(nèi)切酶是一種雙鏈 DNA內(nèi)切酶，這是一類(lèi)與凋亡有關(guān)的核酸內(nèi)切酶（deoxyribonuclease，DNase），統(tǒng)稱(chēng)為凋亡性核酸內(nèi)切酶（apoptotic endonuclease）。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，染色質(zhì)DNA切割的任務(wù)由內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶來(lái)完成。正常條件下，該酶可能以無(wú)活性的形式存在細(xì)胞核內(nèi)，Ca2+、Mg2+可以增強(qiáng)其活性，Zn2+能抑制其活性。

常見(jiàn)的有核酸內(nèi)切酶Ⅰ（DNaseⅠ）、核酸內(nèi)切酶Ⅰ（DNase Ⅱ）、Nuc-18等。經(jīng)過(guò)這類(lèi)酶切割后所產(chǎn)生的DNA最小單位為185bp，其余DNA片段為185bp的倍數(shù)（即185bp的寡聚體）。細(xì)胞內(nèi)的 DNA經(jīng)過(guò)此酶的消化，可以產(chǎn)生類(lèi)似凋亡細(xì)胞的DNA降解現(xiàn)象。對(duì)DNA 的切割動(dòng)力學(xué)分析表明，這種DNA降解片段可以在1~～2h內(nèi)檢測(cè)到。DNA降解過(guò)程從細(xì)胞死亡前5h開(kāi)始，到第24h，絕大多數(shù)凋亡細(xì)胞降解達(dá)到高峰。

1、DNaseⅠ

DNaseⅠ的相對(duì)分子質(zhì)量為32000~37000，對(duì)Ca2+和 Mg2+具有依賴(lài)性，并且可能需要其他輔助因子的參與，因?yàn)榧兓?/span>DNase Ⅰ不能產(chǎn)生DNA梯形條帶，但和核基質(zhì)或血清孵育后，可以恢復(fù)其能促使DNA發(fā)生斷裂的生物學(xué)活性。DNaseⅠ的最適pH值為7.5（5.5～9.0）。其抑制劑有Zn2+、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、二乙基焦磷酸鹽（diethylpyrocarbonate，DEPC）及肌動(dòng)蛋白。DNase Ⅰ分布在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核周的高爾基體內(nèi)，對(duì)其如何進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用目前未完-全闡明。

2、DNaseⅡ

DNaseⅡ的相對(duì)分子質(zhì)量為29000，在細(xì)胞的溶酶體和細(xì)胞核內(nèi)均發(fā)現(xiàn)有DNaseⅡ。DNaseⅡ?yàn)閷?duì)Ca2+和Mg2+非依賴(lài)性的，純化的DNaseⅡ能夠使CHO細(xì)胞核出現(xiàn) DNA梯形條帶。DNaseⅡ的最適pH值為5.5（3.0～7.0），需要在低pH值條件下激活。胞質(zhì)酸化足以激活DNaseⅡ。DNaseⅡ的抑制劑有N-溴琥珀酰胺（N-bromosuccinamide，NBC）和金精三羧酸（aurintricarboxylic acid，ATA）。Zn2+不能夠抑制其活性，但Zn2+可以抑制胞質(zhì)酸化，從而影響DNaseⅡ裂解DNA。

3、NUC18

NUC18是在地塞米松誘導(dǎo)的大鼠凋亡胸腺細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)的，對(duì)Ca2+和Mg2+具有依賴(lài)性，是相對(duì)分子質(zhì)量為18000的中性核酸內(nèi)切酶，為環(huán)孢素A受體（cyclophilin）相關(guān)蛋白，此外，Ribeiro報(bào)道了一種取自脾臟細(xì)胞核，相對(duì)分子質(zhì)量為27000的核酸酶，其最適pH值為8.0，對(duì)Ca2+和 Mg2+具有依賴(lài)性，可以被Zn2+和ATA所抑制。NUC18對(duì)糖皮質(zhì)激素受體具有依賴(lài)性，其活性可被糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU486所抑制；其蛋白質(zhì)的序列與環(huán)孢素A受體相關(guān)蛋白具有顯著類(lèi)似性；在凋亡細(xì)胞中其酶解DNA時(shí)所產(chǎn)生的片段大于180bp，其在細(xì)胞凋亡中的作用有待進(jìn)一步研究。

研究還發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的活性可能與拓?fù)洚悩?gòu)酶有關(guān)。目前已知細(xì)胞內(nèi)有兩類(lèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶，即TopoⅠ和TopoⅡ，其功能是在DNA上產(chǎn)生單鏈和雙鏈缺口，消除染色體 DNA 的阻力，但均不具有內(nèi)切酶的活性。目前對(duì)TopoⅡ更加重視，因?yàn)橛腥颂岢鏊赡芷鹬谷旧w解旋的作用，這樣內(nèi)切酶可以更加容易接近切割點(diǎn)。