匯智和源生物技術（蘇州）有限公司
動員外周血單個核細胞分離方法和注意事項
檢測樣品：動員外周血單個核細胞
檢測項目：動員外周血單個核細胞分離
方案概述：外周血中的干/祖細胞比例明顯增高。動員外周血是指用有效的動員劑對供者進行動員后采集的外周血。重組人粒細胞集落刺激因子（rhG-CSF）是外周血動員的動員劑，它可選擇性的作用于粒系造血祖細胞，促進其增殖、分化，并可增加外周血中性粒細胞的數目和功能。
正常人外周血中的干/祖細胞的含量占有核細胞數的1%左右，經有效動員后，骨髓中的造血干細胞會釋放到外周血中，使外周血中的干/祖細胞比例明顯增高。動員外周血是指用有效的動員劑對供者進行動員后采集的外周血。重組人粒細胞集落刺激因子（rhG-CSF）是外周血動員的動員劑，它可選擇性的作用于粒系造血祖細胞，促進其增殖、分化，并可增加外周血中性粒細胞的數目和功能。動員外周血單個核細胞是采集經動員后的健康供者的外周血，采用密度梯度離心的方法提取其單個核細胞，其各亞型細胞的數量、細胞免疫表型、分泌細胞因子能力和增殖能力等可能會與未動員外周血有一定差異。
1 原理
單個核細胞的體積、形態和比重與其它細胞不同，在沉降過程中不同比重的細胞會處于不同的分布位置。因此，可利用各種血細胞和單個核細胞比重之間的差異將各種血細胞與單個核細胞分離開來。
2 方法
1） 取新鮮抗凝動員外周血，按照1：1比例加入1×稀釋洗滌液，將血液進行稀釋（以降低血液粘稠度），輕柔混勻，備用。
2） 向無菌離心管內加入適量的單個核細胞分離液，將稀釋后的血樣平鋪到分離液液面上方（分離液：稀釋動員外周血=1：2），保持兩液面界面清晰。
3） 800g，室溫，離心 20min-30min（注：設置較慢的加速度和減速度，如果有十檔，設為第三檔）。
4） 離心結束后，吸棄血漿層，小心吸取PBMC層（即白膜層）并轉移至15mL離心管中。離心結束后，管內液面從上至下依次為稀釋血漿層、PBMC層、分離液層和紅細胞層（見圖1）。
圖1 稀釋動員外周血離心前后的分層狀態圖
5） 向離心管中加入10mL 重懸細胞，250g，室溫離心 10min ，棄上清。重復該步驟 1~2 次，即可用于后續試驗。
3 注意事項
1） 血液新鮮程度是影響分離效果的關鍵因素，請盡量使用采集后24h內的血液進行PBMC分離。
2） 為保證細胞的活力，整個操作過程請輕柔，避免對細胞造成機械性的損傷。
3） 為保持細胞狀態良好，請盡量縮短整個試驗的周期。
4 動員外周血單個核細胞分離試劑盒
IPHASE/匯智和源針對動員外周血單個核細胞分離的特點，開發了對應的單個核細胞分離試劑盒。該試劑盒包含單個核細胞分離液和洗滌液兩個組分，各成分對細胞無毒性，不會影響細胞的原始狀態；同時，該試劑盒操作簡單便捷，可大大縮短細胞分離時間，分離所得細胞純度高、狀態好、得率高。
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