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酶聯(lián)斑點(Elispot)實驗服務(wù)

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   公司承接各種實驗代做外包服務(wù):石蠟包埋、免疫組化、HE染色、PAS染色、DNA提取、RNA提取、探針、SNP檢測、WBEMSACCK8檢測、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期檢測、流式、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、ROS活性氧檢測、線粒體膜電位檢測、平板克隆、軟瓊脂克隆、細(xì)胞劃痕、細(xì)胞粘附,并為廣大科研用戶提供各種高品質(zhì)的高*_端化學(xué)試劑、生物學(xué)試劑、免疫學(xué)檢測,ELISA試劑盒(免費代測)、生化試劑盒、分析標(biāo)準(zhǔn)品、對照品、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)食品安全檢測試劑、動物疫病類檢測產(chǎn)品獸藥殘留檢測試劑、細(xì)胞培養(yǎng)服務(wù)等,應(yīng)用覆蓋藥物分析領(lǐng)域、食品安全領(lǐng)域、聚合物研究領(lǐng)域、環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域,客戶廣泛分布于食品、制藥、第三方檢測、環(huán)境測試機構(gòu)、化工、科研院校、生物工程等行業(yè)。


主營:

1生化試劑標(biāo)準(zhǔn)品對照品、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

2.ELISA試劑盒、分離液、分離液試劑盒

3.細(xì)胞:*細(xì)胞、國產(chǎn)腫瘤細(xì)胞、國產(chǎn)正常細(xì)胞、腫瘤耐藥細(xì)胞

4.食品安全檢測試劑、動物疫病類檢測產(chǎn)品獸藥殘留檢測試劑

5.耗材:常用實驗耗材、移液器


各種實驗代做:WB代做,免疫組化,PCR代做,細(xì)胞檢測,食品安全檢測試劑,獸藥殘留檢測試劑,動物疫病類檢測,銷售高品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品,對照品,ELISA試劑盒,細(xì)胞,血清,等等

應(yīng)用領(lǐng)域 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè)

酶聯(lián)斑點(Elispot)實驗服務(wù)

 

 

酶聯(lián)斑點(Elispot) 技術(shù)概述:

酶聯(lián)斑點(Elispot) 全名為酶聯(lián)免疫斑點檢測,英文: Enzyme-linked Immunospot Assay.它結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(即ELISA技術(shù)), 能夠在單細(xì)胞水平檢測細(xì)胞因子的分泌情況。其技術(shù)原理,一句話概括就是:用抗體捕獲培養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,并以酶聯(lián)斑點顯色的方式將其表現(xiàn)出來。

 

 

1、實驗的準(zhǔn)備工作

(1)設(shè)備與耗材:

①超凈工作臺;

②5% CO2 37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱;

③P20,P200, P1000 微量移液器,

④P300 8通道微量移液器,P300 12通道微量移液器,

⑤Biosys ELISPOT Reader

⑥P20,P200, P1000 槍頭;

⑦多道移液器吸槽;

⑧0.5mL, 1.5mL EP管。

 

(2)溶液配制

①PBS:用分析純試劑,Millipore級別的純水配制, 高壓滅菌。

②PBST: PBS加入0.05% Tween-20,注意無菌操作。儲存于20-25°C, 可存放一個月。

③70%乙醇:分析純乙醇70mL,加入Millipore級別的純水至100mL。

④30%乙醇:分析純2醇30mL,加入Millipore級別的純水至100mL.

⑤包被抗體(coating antibody, Primary antibody): 照U-Cytech說明書,加入雙蒸水溶解。使用時,用PBS稀釋50倍,每孔50uL。

⑥封閉液:用PBS將試劑盒中的封閉存儲液(Blocking stock solution R)稀釋10倍,每孔200uL。

⑦抗體稀釋液:注意,只是用來稀釋檢測抗體和酶聯(lián)親和素。用PBS將試劑盒中的稀釋存儲液(Dilutionbuffer R)稀釋10倍

⑧檢測抗體(Biotinylated detector antibody, Secondary antibody):照U-Cytech說明書, 加入雙蒸水溶解。使用時,用抗體稀釋液稀釋100倍,每孔100uL。

⑨酶聯(lián)親和素(Streptavidin-HRP conjugate):照U-Cytech說明書,加入雙蒸水溶解。使用時,用抗體稀釋液稀釋100倍,每孔100uL。

D AEC顯色液: 照U-Cytech說明書, 用100mL 30%乙醇溶解底物緩沖液膠囊(Substrate bufercapsule),然后加入3.3mL AEC儲存液(AEC stock solution),混合均勻后10ml每支分裝,-200C保存。

使用時,解凍,每孔加入100pL.

①PHA刺激物:將儲存液(2mg/ml,Murex)分裝成20μL/EP管, -20*C長期凍存。 使用時,加入980μLU-Cytech無血清培養(yǎng)基(或者1640基本培養(yǎng)基),成為工作液(40μg/mL,10倍終濃度),每孔加入10μL, 終濃度4μg/mL。

②U-Cytech無血清培養(yǎng)基:我們推薦無血清ELISPOT技術(shù),它能排除血清的干擾,結(jié)果更加穩(wěn)定可靠,背景也更好。如果沒有,可以用含10%血清的1640培養(yǎng)基代替。

2、ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序

(1)第—天: ELISPOT包被程序設(shè)計好試驗,把每個孔要加入的內(nèi)容做成卡片,到時候就會從容很多。每孔加入15μL 70%的醇預(yù)濕30秒。

注意:

①未潤濕的PVDF膜是潔白的、不透明的,經(jīng)過乙醇潤濕之后,顏色變暗,變成半透明狀,很容易觀察二者的區(qū)別。

②加乙醇的時候,槍頭應(yīng)該靠在孔壁接近孔底的地方,注意槍頭不到刺到PVDF膜。

③有時候,加入的乙醇掛在孔壁上, 這時要蓋上板蓋,輕輕叩擊,讓乙醇順勢滑落。乙醇一 旦接觸到PVDF膜,就會在表面張力和毛細(xì)作用之下迅速浸潤整塊膜,使得膜的顏色和透明度發(fā)生變化。

④15μL 是經(jīng)過優(yōu)化的體積,它能保證剛好*浸潤整塊膜,而不會有剩余。如果加大使用量,乙醇溶液就會透過膜而積存在膜的背面,加深實驗的背景。

⑤加入100μL去離子水洗滌三次,盡量減少乙醇的殘留。

⑥按照試劑盒的使用說明,將包被抗體儲存液稀釋在PBS緩沖液中,每孔加入50μL,4°C包被過夜。

⑦(次日)傾倒包被液,用PBS洗滌5次,后一次,在滅菌的吸水紙上扣干。

⑧加入200μL試劑盒自帶的稀釋好的封閉液,37°C封閉1小時。

⑨傾倒封閉液,無須洗滌,直接可以進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。(也可以用PBS緩沖液或者純水洗滌- -次, 拍干,封口,4°C保存,可以在4°C保存數(shù)周。)

 

(2)第二天:鋪細(xì)胞,加入刺激物,培養(yǎng)

①整個實驗設(shè)置-組正對照(PHA刺激), 每一個細(xì)胞樣品(同-個捐獻(xiàn)者或者實驗動物)要設(shè)一個負(fù)對照

(不加刺激物),整塊板還要加一個背景負(fù)對照(不含細(xì)胞,只加培養(yǎng)基和所有的檢測試劑)。

②填好實驗卡片,用以指導(dǎo)實驗的安排和細(xì)胞及試劑的添加。每一個細(xì)胞/刺激物的組合設(shè)置2-4個孔的重復(fù)(想要有統(tǒng)計學(xué)的意義,每個細(xì)胞/刺激物設(shè)4個孔的重復(fù))。

④取出封閉好的板,準(zhǔn)備加入細(xì)胞。如果是以前做的封閉,可以加入200μL 的U-Cytech無血清培養(yǎng)基,室溫靜置10分鐘,傾倒,然后再重復(fù)- -次。

⑤按照實驗卡片的安排,加入不同濃度的細(xì)胞,100uLwell, 細(xì)胞在孔中的分布要盡量均勻(要訣是加入

細(xì)胞之后,不要再震動或者拍擊ELISPOT板。有人認(rèn)為拍擊板子會讓細(xì)胞更分散,實際情況剛好相反)。正對照的細(xì)胞濃度為1x105/well,實驗組的樣品細(xì)胞濃度請自行調(diào)整。

⑥加入100μL的U-Cytech無血清培養(yǎng)基到背景負(fù)對照孔。

⑦正對照孔加入10μL PHA,終濃度4ug/mL,該濃度能有效刺激IFN-V的分泌。

⑧加入實驗者自己的刺激物(配制成10X終濃度,10uLwell)到實驗孔。 加完刺激物之后不要再拍擊ELISPOT板。有人認(rèn)為拍擊板子會讓刺激物在孔中混合均勻,實際上,通過擴散,刺激物也會很快混合均勻。拍擊板子會讓細(xì)胞成圈的分布在孔的外周。

⑨當(dāng)加完所有的樣品之后,蓋上板蓋,放入二氧化碳培養(yǎng)箱,37°C培養(yǎng)18-24小時。 注意在整個培養(yǎng)過

程中避免移動、碰撞培養(yǎng)板。為了取得更好的結(jié)果,甚至開關(guān)培養(yǎng)箱的箱[ ]也應(yīng)該禁止。因為碰撞會造成細(xì)胞的移位,造成斑點的模糊、拖尾。

 

(3)第三天:培養(yǎng)后操作

①傾倒孔內(nèi)的細(xì)胞及培養(yǎng)基。

②低滲法將細(xì)胞裂解,每孔加入200μL冰冷的去離子水,將板置于冰上冰浴10分鐘。

③每孔用200μLPBST洗滌10遍,洗滌后- 遍之后,將板倒扣在吸水紙上拍干。

④按照試劑盒說明的濃度,用抗體稀釋液稀釋檢測抗體,每孔加入100μL生物素標(biāo)記的檢測抗體,37°C 1小時。

⑤每孔用200μL PBST洗滌5遍,洗滌后一遍時, 將PVDF膜板的背面的塑料保護(hù)層取下,同時洗滌膜的正反兩面,蓋上保護(hù)層,將板倒扣在吸水紙上拍干。

 

注意:

①洗滌膜的背面,我們摸索出的辦法是,在-個淺托盤中盛上干凈的PBST,將膜板的底面浸入,輕輕搖晃幾次即可。注意,-定要將膜的背面和塑料保護(hù)層上的液體甩干之后,再合攏,蓋上,不要傷害到膜。

②按照試劑盒說明的濃度,用抗體稀釋液稀釋酶標(biāo)的鏈霉親和素,每孔加入100L, 37°C 1小時。

③每孔用200μL PBST洗滌5遍, 洗滌后-遍時,將PVDF膜板的背面的塑料保護(hù)層取下,同時洗滌膜的正反兩面,蓋上保護(hù)層,將板倒扣在吸水紙上拍干。

④照試劑盒的說明,解凍已配好的AEC顯色液。每孔加入100μL的顯色液,室溫靜置20-30分鐘,注意避光。

⑤待斑點生長到適合的大小之后,以去離子水洗滌2遍,終止顯色過程。將板倒扣在吸水紙上,拍干細(xì)小的水珠,之后取下保護(hù)層,放在通風(fēng)的地方,室溫靜置10-30分鐘,讓膜自然晾干。注意不要將板放到烤箱內(nèi),防止膜發(fā)脆、破裂。

⑥將ELISPPOT板置于Biosys Bioreader4000 PRO自動讀板儀內(nèi),調(diào)節(jié)好合適的參數(shù),半點計數(shù),并記錄斑點的各種參數(shù),作統(tǒng)計分析。

 

酶聯(lián)免疫(ELISA)技術(shù)服務(wù)

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