凱基Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒

一、原理

在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca²⁺依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將Annexin V進行熒光素（EGFP、FITC）標記，以標記了的Annexin V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來。

二、試劑盒組份

三、操作步驟

1．   懸浮細胞離心（2000rpm離心5min）收集；貼壁細胞用不含EDTA的胰酶消化收集（注：胰酶消化時間不易過長，否則容易引起假陽性）；

2．   用PBS洗滌細胞二次（2000rpm離心5min）收集1~5×10⁵細胞；

3．   加入500μL的Binding Buffer懸浮細胞；

4．   加入5μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻；

5．   室溫、避光、反應5～15min；

6．   請在1 hour內，進行下述熒光顯微鏡或流式細胞儀的觀察和檢測。

A．  熒光顯微鏡觀察

1．   滴一滴上述染色后的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞；

2．   對于貼壁細胞來說，也可直接用蓋玻片來培養細胞并誘導細胞凋亡；

（1）         將細胞于蓋玻片上生長，用適當的凋亡誘導劑誘導細胞凋亡，并設立陰性對照組；

（2）         用PBS洗滌細胞兩次；

（3）         在500μL 的Binding Buffer中加入5μL Annexin V-FITC， 5 μL Propidium Iodide，混勻；

（4）         將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使長有細胞的蓋玻片表面均勻覆蓋；

（5）         避光、室溫反應5 min。

3．   將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下、雙色濾光片（FITC和羅丹明）觀察

Annexin V-FITC熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色。

B．   流式細胞儀分析

用流式細胞儀檢測，激發波長Ex=488 nm; 發射波長Em=530 nm。

Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道（FL1）檢測；PI紅色熒光通過PI通道（FL2或FL3）檢測，建議使用FL3。

熒光補償調節：使用未經凋亡誘導處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償調節去除光譜重疊和設定十字門的位置。

四、注意事項

1．  Annexin V-FITC，Propidium Iodide （PI）避光保存及使用。

2．  Propidium Iodide （PI）有毒，操作時要戴手套。

3．  本試劑盒適用于檢測活細胞，流式細胞儀檢測時，細胞數量不以應低于1×10^5，，不適用于檢測組織樣本。

4．  *使用懸浮培養細胞，如果是貼壁細胞，用胰酶消化不當，會引起假陽性，而用細胞刮子會造成細胞粘連成團，而影響檢測?？蓪⒁让赶蠹毎谋４嬖诤?%BSA的PBS中，防止進一步的損傷。

5．   因檢測細胞的類型、凋亡誘導劑種類、使用的檢測儀器不同，因而流式檢測的熒光補償也不同，因此建議每次檢測均需使用未經凋亡誘導處理的細胞作為對照，進行熒光補償的調節。

五、儲存        置于4⁰C，可保存一年