儲存于 -20?C.

1.       概述

本產品利用特殊的重組原理，不依賴于連接酶，可實現簡單、快速、高效的DNA定向克隆。載體可通過任意方法線性化，然后與兩端含有15~25bp載體同源區域的PCR片段重組，反應時間短，重組效率>95%，并可實現多至5個片段的高效無縫克隆。

2.   優勢        

l                      可插入任意載體的任意位置

l                      一步，簡單，準確，快速地進行多片段定向克隆，反應僅需15min，效率高達95%

l                      不依賴于連接酶，PCR產物無需酶切，無需磷酸化

l                      無縫連接，不引入額外序列

3.       克隆實驗流程

I:        載體線性化，可酶切或通過PCR方法

II:        目的片段制備，PCR產物5’和 3’最末端的序列分別和線性化克隆載體兩末端序列wanquan一致

III:        載體，目的片段按摩爾比~1:3與克隆試劑混勻，50°C孵育15~30min

IV:        反應產物轉化

4.       具體克隆實驗操作

I:        載體線性化

線性化載體是克隆成功的重要前提，可通過酶切獲得，平末端或者粘末端均可，雙酶切更有利于降低背景；也可提供PCR擴增獲得，高保真DNA聚合酶可避免產生不必要的突變。

II:        引物設計

目的片段擴增所需的正反向引物除含有與自身匹配的特異性序列外，均需含有與載體末端同源的15~25bp重疊序列，如需添加酶切位點，接頭序列，標簽序列等，可添加在二者之間。即：

PCR Forward Primer = 載體正向overlap序列(15~25bp)+中間酶切位點等序列+目的片段正向特異性序列(20~25bp)

PCR Reverse Primer = 載體反向overlap序列(15~25bp)+中間酶切位點等序列+目的片段反向特異性序列(20~25bp)

若要克隆多個目的片段，片段間引物設計原理與上相同。

III:        目的片段制備

目的產物需選用高保真DNA聚合酶進行擴增，由于PCR引物通常較長，退火溫度可根據特異性區Tm值及聚合酶本身確定。

IV: 克隆反應體系

反應物輕輕混勻后，50°C 15~30min。反應結束后可直接用于后續轉化或者-20°C保存備用。

注：1）重組片段為2~3段時，載體與各片段加入量約為0.02 – 0.5 pmols，重組片段為4~6段時，載體與各片段加入量約為0.2 – 1 pmols，載體與加入目的片段的zuijia摩爾比為1:3

2）重組片段較多時，可適當延長反應時間至1h

V:        轉化

1.  把感受態細胞置于冰中解凍；

2.  加入用于轉化的重組反應產物20μl ，冰中放置30min后，42℃ 熱激60～90s；

3.  繼續冰上放置2min；

4.  添加 500 μl S.O.C 或者 LB培養基， 37?C 搖床培養 1 h；

5.  將轉化菌液離心后棄上清，輕輕將 沉淀懸浮后均勻涂布于含有適宜抗性的LB平板上；

6.  37?C 倒置過夜培養

5.       注意事項