伊文思藍(lán)染色液(0.5%)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

伊文思藍(lán)（Evans Blue）又稱(chēng)偶氮藍(lán)，分子式C₃₄H₂₄N₆Na₄O₁₄S₄，分子量為960.80，CAS號(hào)為314-13-6。伊文思藍(lán)屬于一種常用的偶氮染料制劑，因其分子量大小與血漿白蛋白相近，而且在血液中與血漿白蛋白有很高的親和力，因此在神經(jīng)科學(xué)研究中常被用于示蹤觀察血腦屏障（BBB）的完整性，也用于細(xì)胞染色區(qū)分活細(xì)胞、死細(xì)胞，亦可測(cè)定血容量。伊文思藍(lán)作臨床藥物用于測(cè)定血漿和血容量，也可作動(dòng)脈插管的定位。正常情況下血漿白蛋白無(wú)法透過(guò)血腦屏障，所以染色后如果神經(jīng)系統(tǒng)血腦屏障完整，與血漿白蛋白結(jié)合的依文思藍(lán)無(wú)法使其著色。相反，如果神經(jīng)系統(tǒng)血腦屏障被破壞，依文思藍(lán)就可以進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)并使其著色。在熒光波長(zhǎng)470nm、540nm處有強(qiáng)峰，680nm處有弱峰。可以使用化學(xué)透析法和比色法進(jìn)行檢測(cè)。

伊文思藍(lán)與臺(tái)盼藍(lán)都是細(xì)胞活性染料，常用于檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性和細(xì)胞是否存活。活細(xì)胞不會(huì)被染成藍(lán)色，而死細(xì)胞會(huì)被染成淡藍(lán)色。伊文思藍(lán)染色后，通過(guò)顯微鏡下直接計(jì)數(shù)或顯微鏡下拍照后計(jì)數(shù)，就可以對(duì)細(xì)胞存活率進(jìn)行比較精確的定量，其中0.5%為常用的濃度。活細(xì)胞因有外排功能而無(wú)法被伊文思藍(lán)染色，因此可以通過(guò)此方法在顯微鏡下區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞，但無(wú)法區(qū)分死亡與壞死。

自備材料：

1、 注射器、組織勻漿器

2、 PBS

3、 C2HCl3O2或丙酮

操作步驟（僅供參考）：

（一） 血腦屏障通透性

1、 取處理后的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（以小鼠為例），靜脈注射Evans Blue Stain(0.5%)數(shù)秒至1分鐘內(nèi)，小鼠眼睛、皮膚出現(xiàn)藍(lán)色。0.5~1h后處死小鼠，取目的腦組織。

2、 腦組織置于1.5ml離心管中，加入1ml PBS，迅速用組織勻漿器將腦組織制成勻漿，1000g離心15min。

3、 取上清，加入等量C2HCl3O2，4℃孵育18~24h。該步驟亦可采用如下操作：取上清，按上清:丙酮=3:7比例加入丙酮，室溫孵育24h。

4、 1000g離心20~30min或2000g離心15min。

5、 取上述溶液1~2ml，用分光光度計(jì)測(cè)620nm處吸光值（OD值）。同時(shí)測(cè)定已知不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)文思藍(lán)的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的依文思藍(lán)含量。

（二） 活細(xì)胞染色

1、 取100μl重懸細(xì)胞到常規(guī)1.5ml或0.5ml離心管內(nèi)，入100μl Evans Blue Stain輕輕混勻，染色3min（染色時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)，但不宜超過(guò)10min）。

2、 吸取少量經(jīng)過(guò)染色后的細(xì)胞，計(jì)數(shù)。通常如果要比較精確地進(jìn)行定量，每個(gè)細(xì)胞樣品至少數(shù)500個(gè)細(xì)胞，數(shù)出藍(lán)色細(xì)胞和細(xì)胞總數(shù)。細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下：

           細(xì)胞存活率=（細(xì)胞總數(shù)-藍(lán)色細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)×%

注意事項(xiàng)：

1、 Evans Blue Stain對(duì)人體有輕微素性，請(qǐng)小心防護(hù)。

2、 細(xì)胞染色時(shí)，注意凋亡小體偶爾也有拒染現(xiàn)象。

3、 血腦屏障通透性實(shí)驗(yàn)中，Evans Blue Stain注射量應(yīng)根據(jù)不同動(dòng)物以及動(dòng)物的重量調(diào)整。

4、 采用低溫冷凍離心機(jī)進(jìn)行離心。

5、 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

產(chǎn)品組成：