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技術文章
堿性磷酸酶偶氮―偶聯 法
點擊次數：1329 發布時間：2015-3-3
人工合成的磷酸萘酚鹽經堿性磷酸酶 水解后釋放出萘酚，后者立即與重氮鹽偶聯生成不溶性偶氮色素。
1)孵育液配制
萘酚AS(或萘酚AS-MX) 10―25rug
N，N―二甲基甲酰胺液 0．5ml
0．2mol／LTris鹽酸緩沖液(pH 8．2―9．2) 50ml
堅牢藍B(或BB、RR，或堅牢紅TR、堅牢藍VRT) 50mg
混合、攪拌及過濾，必要時可使用氫氧化鈉調整pH。
2)操作程序：
①新鮮組織冰凍切片：
②人孵育液，37C(或室溫下)孵育5―60分鐘；
③雙蒸水洗3～5分鐘；
④4％甲醛，室溫下固定10～15分鐘；
⑤蒸餾水洗3～5分鐘；
⑥甘油明膠封固。
3)結果與評價：采用不同的重氮鹽。酶的活性顯色也不同，用堅牢藍B(或BB、RR)酶活性呈藍紫色，用堅牢紅TR(或堅牢紫B)酶活性呈紅色。萘酚法有三個優點：
①反應產物溶解度小。局部比較明顯；
②萘酚化合物能較快地被水解，可縮短孵育時間；
③反應產物立即可見，并顯示出顏色。
4)對照實驗：方法與鈣―鈷法相同。