嘉美免疫組化實驗特色介紹

一、嘉美實驗可以提供：實驗所需抗體，即提供一抗

二、嘉美實驗可以提供：提供一抗之外，所有免疫組化實驗試劑

三、實驗委托者只需要提供：組織、蠟塊、切片，任意一種標本即可


 

一、免疫組化實驗介紹

免疫組化是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細胞內抗原(多肽蛋白質)，對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。

二、免疫組化主要步驟（sABC法為例子）

1. 洗載玻片: 將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中,目的是為了是載玻片上的硅膠等除去,同時使一些肉眼看不見的凹凸不平的表面變平整,便于組織吸附,然后置于清水中清洗,除去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4(大約沖一個小時左右),再將載玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C溫箱中，將多聚賴氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys帶正電，而大多數的組織帶負電荷，從而產生吸附作用。

2. 包埋組織: 先在鐵模具中加入一些液態石蠟，先稍微冷卻，然后再將待包埋的組織置于石蠟之中，并排列整齊，再將塑料模具盒蓋上，后加入少許液體石蠟，進行冷凍，使石蠟變成固態。

3. 切片：將包埋好的組織從模具上取下來，并置于石蠟切片機上，切片機通過調節上下左右來來使組織和切割方向*，然后調節切片的厚度，一般為5 um,如果比較難切，則可以適當調整厚度，用毛筆將切割的載玻片向外拉，并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40°C溫水中。

4. 撈組織：當組織載玻片置于40°C溫水中之前，要先將水浴中的氣泡趕走，以免氣泡受熱上浮而貼到組織上，組織受熱展開，Best是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時，一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張，其中2-3張是備用的，每張載玻片上通常撈兩份組織，做對照使用，這樣形成的誤差就比較小了，而且撈載玻片的時候Best方向*，以便觀察，再將撈出來的載玻片置于架子上，放入37°C溫箱中烘干。

5. 脫蠟：依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-*酒精-*酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯,依據的是相似相溶的原理.一般在每個試劑中放10min,天氣熱可以少放幾分鐘,相反,天氣較冷的話,就要適當延長脫蠟時間,一般為12-15min.

6. 抗原修復：脫蠟后在清水中沖洗一段時間，加入3%H2O2浸泡10min，從而除去內源性的過氧化氫酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3min（中火），一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位點暴露出來。

7. 血清封閉：冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉，水洗2次，并將載玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干組織周圍的PBS液，馬上加上血清，使一些非特異性的位點封閉起來，然后放入37°C溫箱中半小時。血清稀釋10倍（血清封閉液）。

8. 加一抗：將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清，加一抗，如果做對照實驗，就在對照的組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過夜。

9. 加二抗：將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上二抗,然后置于37°C溫箱中半小時。

10. 加SABC: 將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上SABC, 然后置于37°C溫箱中半小時。SABC稀釋100倍。

11. 加顯色劑: 將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）   A：DAB        B：H2O2        C：磷酸緩沖液

12. 復染: 將顯色后的片子用清水沖洗一段時間后，浸泡于蘇木精中染色，一般動物組織為半分鐘，植物組織3-5min。

13. 脫水：將復染后的片子置于水中沖洗后，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-*酒精-*酒精-二甲苯-二甲苯。每個試劑中放置2min，后浸泡在二甲苯中，搬到通風柜中。

14. 封片：用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側，然后輕輕放下另一側，以免產生氣泡，封好片子后置于通風柜中晾干。

三、免疫組化試劑

【免疫組化的相關試劑】：重要的是選擇好一抗、二抗或者還有三抗，注意抗體的特異性、效價和交叉反應。

【其他常用試劑有】：

1、0.01M(pH7.4)的磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS），稀釋抗體和洗片子用；

2、清潔液、純水，洗玻片用

3、多聚賴氨酸處理載玻片，防止脫片

4、固定液：4%多聚甲醛或冷丙酮等；

5、15%~30%蔗糖，組織脫水用；

6、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，或者OCT包埋做冰凍切片；

7、抗原修復液：枸櫞酸緩沖液（pH6.0）；

8、活化劑：EDTA或者Triton X-100；

9、1%~10%牛血清清蛋白（BSA）封閉液；

10、H2O2，滅活內源性過氧化物酶；

11、顯色液：根據你做的酶來選擇，如果是HRP就用DAB，如果是AKP，就用NBT/BCIP，免疫熒光則不需要；

12、50%緩沖甘油封片液。
 

四、免疫組化樣本說明

1、石蠟切片

取材：1、組織離體后需及時固定；2、組織標本不宜過大、過厚。

固定：1、固定液：10%福爾馬林（4%多聚甲醛）或10%中性甲醛；2、用量：一般固定液的量與組織體積比為10:1～20:1；3、固定：適宜的固定時間，主要根據材料的大小、松密程度及固定液的穿透速度而定。

保存：切片經60℃烤片3-5小時后，可于常溫或4℃干燥保存。

2、冰凍切片

取材：取材后需立即置于超低溫冰箱或液氮中保存。

固定：樣本冰凍切片后，應立即放入甲醇、丙酮、95%酒精、4%多聚甲醛等固定液中固定。

保存：固定好的切片自然風干，密封后置于-80℃、-20℃保存，盡快用于后續實驗。

3、細胞塊石蠟切片

細胞量較多的樣品，可離心分離所需細胞，用中性甲醛固定后制作成瓊脂細胞塊，然后按照制作石蠟切片的操作流程進行切片。

4、細胞爬片

在孔板里做的細胞爬片，爬片取出后，用PBS洗滌2次（根據研究目的，PBS洗滌可選擇不做），用4%多聚甲醛4℃固定15分鐘，將表面液體吹干，置于-20℃保存。若在短時間內即開展實驗，可在加固定液后，于4℃冰箱中放置一段時間。

5、細胞涂片

細胞涂片常用的固定液有95%酒精（較為常用）、酒精-冰醋酸液、Ethyl ether-酒精液和Carney’s液等。 

五、免疫組化實驗注意事項

1、常用的固定液為中性甲醛和4%多聚甲醛，能使大多數抗原保存良好，適用于免疫組織化學。

2、病理實驗切片Best是防脫片，以免實驗過程中出現掉片。若客戶提供切片，應告知切片有無防脫處理。

3、骨組織、皮膚組織或脂肪含量較高的樣本，實驗過程中有較高的掉片幾率。

4、客戶可提供組織塊（以10%福爾馬林、4%多聚甲醛或10%中性甲醛固定，如組織塊極小請事先說明）、蠟塊或切片（使用免疫組化切片，以避免實驗過程中掉片）

5、待檢測蛋白的種屬、實驗分組情況及實驗背景資料、其他具體要求等需事先說明。

6、若客戶提供骨組織或鈣化程度較高的組織進行實驗，需進行脫鈣處理。

7、浸泡在固定液中的組織樣本，在運輸中容器需密封，防止破碎、滲漏。