酶聯(lián)免疫檢測試劑盒原理：

酶聯(lián)免疫檢測試劑盒DRGT采用雙抗體夾心法測定人雄激素結(jié)合蛋白（ABP）水平。用純化的人雄激素結(jié)合蛋白（ABP）抗體包被微孔板，制成固相載體，實驗時依次在微孔板中加入樣本及標(biāo)準(zhǔn)品，并加入HRP標(biāo)記的ABP抗體，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，反復(fù)洗滌后加底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，再用硫酸終止反應(yīng)，轉(zhuǎn)變成黃色。顏色的深淺和樣品中的ABP含量呈正相關(guān)。采用酶標(biāo)儀在450nm波長測定吸光度（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算測試樣品中ABP濃度。 

實驗材料與試劑配制：

1. 儀器與材料：酶標(biāo)儀（使用前預(yù)熱30分鐘），微量加液器、吸頭、蒸餾水或去離子水，濾紙。

2. 緩沖液使用：加5ul的緩沖液于50ul的樣品中，如果樣品量不夠或者不確定，緩沖液和樣品的混合比例不要小于1:10即可。混勻，靜置1小時備用（如果標(biāo)本是血清或者血漿，此步驟忽略）。

3. 洗液的配制：按1:100的比例配制洗液備用。

樣品收集、處理及保存：

1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：適用于檢測體外培養(yǎng)的細(xì)胞分泌性成份。用無菌管收集細(xì)胞上清液，以1000×g離心15分鐘，收集上清。

2. 細(xì)胞：用PBS反復(fù)洗滌細(xì)胞3次，調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)到104-106/ml左右，通過反復(fù)凍融，使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份，或者細(xì)胞超聲粉碎，離心取上清液檢測。

3. 血清：在室溫下，血液自然凝固，以1000×g離心15分鐘，取上清待測。

4. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合后靜置10-20分鐘后，以1000×g離心15分鐘，收集上清。

5. 體液：包括胸腹水、腦脊液，分泌物等。使用不含熱原和內(nèi)毒素的離心管收集，以1000×g離心15分鐘，收集上清。

6. 組織標(biāo)本：切取組織標(biāo)本，稱取重量0.5mg，加入500ul的PBS，用手工或勻漿器，或超聲破碎儀將標(biāo)本勻漿，以2000-3000rmp離心20分鐘，收集上清進(jìn)行檢測。

7. 樣品中不能含有NaN3，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

8. 保存：如果樣品不能立即檢測，應(yīng)將其分裝，-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍。保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。血液標(biāo)本盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中含大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

酶聯(lián)免疫檢測試劑盒DRGT操作步驟：

1. 取出試劑盒，室溫（20-25℃）放置30分鐘。

2. 分組：取出96孔板，根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)，把剩余的板條繼續(xù)冷藏處理。分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品組（6個濃度）、空白孔、待測樣品組。

注：為減少實驗誤差，保證準(zhǔn)確性，建議設(shè)置復(fù)孔。

3. 加樣：依照標(biāo)準(zhǔn)品的順序分別加入50ul的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中；空白對照孔加入50ul的蒸餾水；其余微孔中加入 50ul的待測樣本。

4. 加酶標(biāo)溶液：標(biāo)準(zhǔn)品組、待測樣本組各孔中加入100ul 的酶標(biāo)溶液（空白對照孔除外）。

5. 溫育：酶標(biāo)板用封板紙密封后，放入濕盒內(nèi)于37℃恒溫孵育1小時。

6. 洗板：用稀釋后的洗滌液注滿每孔，靜置15-30s，充分清洗酶標(biāo)板5次，用吸水紙拍干。

7. 顯色：各孔加入顯色劑A液50ul后，再加入顯色劑B液50ul。

8. 終止：25-37℃下避光反應(yīng)10-15分鐘，加入50ul終止液。

9. 讀板：在450nm波長讀取各孔的OD值。

注：讀板時必須拭干板底殘留的液體和手指痕跡，讀板時間控制在終止反應(yīng)后的30分鐘內(nèi)，以免影響準(zhǔn)確性。