一、細胞基本屬性：

包被條件： 

培養基：原代樹突狀細胞培養體系

換液頻率：每2-3天換液一次

傳代比例：

消化液：0.25%胰蛋bai酶

培養條件：氣相：空氣 ，95%；  CO2 ，  5%

原代細胞實驗步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超凈工作臺中，將大鼠斷頭置于玻璃培養皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養皿中，去除小腦和間腦。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養皿中。

四、用細解剖鑷去除大腦白質、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質。

五、大腦皮質放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室溫1 000×g離心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培養液懸浮混勻，鋪于經離心形成連續梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。

十、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM

漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。

加入DMEM培養液(20％FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養皿中，置于37℃、5％CO2培養箱內靜置培養24h后更換不含嘌呤霉素的混合培養基，隨后隔天換液。

公司正在出售的產品：
人胰腺癌細胞AsPC-1(STR鑒定正確)

人食管癌細胞TE-7(STR鑒定正確)
人乳腺導管癌細胞BT-549(STR鑒定正確)
人支氣管良性腫瘤NCI-H727(STR鑒定正確)
人子宮內膜癌細胞HEC-1-A(STR鑒定正確)
大鼠肝星形細胞CFSC-8B（種屬鑒定）
大鼠垂體瘤細胞MMQ(種屬鑒定)
人正常結腸上皮細胞 CCD841 CON (STR鑒定正確)
人卵巢癌細胞IGR-OV1 (STR鑒定正確)
人胚胎心肌組織來源細胞CCC-HEH-2(STR鑒定正確)
人肝癌細胞Hep 3B2.1-7(STR鑒定正確)
人胃癌細胞MKN-28(STR鑒定正確)
小鼠膀胱移行癌細胞MBT2（種屬鑒定）
小鼠白血病細胞P388（種屬鑒定）
大鼠肝癌細胞H4-II-E-C3（種屬鑒定）
Sporolactobacillus nakayamae subsp. nakayamae中山乳芽孢桿菌中山亞種
Aliivibrio fischeri費氏另類弧菌
Sporolactobacillus terrae土乳芽孢桿菌
Xanthobacter autotrophicus自養黃色桿菌
Serratia sp.氏菌
Burkholderia pickettii皮氏伯克霍爾德氏菌
Arthrobacter chlorophenolicus氯酚節桿菌
Arthrobacter sulfonivorans食砜節桿菌
Arthrobacter citreus檸檬節桿菌
Arthrobacter nicotinovorans噬尼古丁節桿菌
人DC細胞Agromyces brachium細枝農霉菌
Agromyces luteolus藤黃色農霉菌
Lactococcus lactis subsp. cremoris乳酸乳球菌乳脂亞種

Agromyces mediolanus米蘭農霉菌
Lactobacillus agilis敏捷乳桿菌

原代細胞使用方法：

是一種半懸浮細胞細胞，細胞形態呈，在技術部標準操作流程下，細胞可傳2-3代；建議您收到細胞后盡快進行相關實驗。

客戶收到細胞后，請按照以下方法進行操作。

1. 取出T25細胞培養瓶，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中靜置3-4h，以穩定細胞狀態。

2. 貼壁細胞消化

1)吸出T25細胞培養瓶中的培養基，用PBS清洗細胞一次；

2)添加0.25%消化液1mL至T25培養瓶中，輕微轉動培養瓶至消化液覆蓋整個培養瓶底后，吸出多余消化液，37℃溫浴1-3min；倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后，再加入5ml培養基終止消化；

3)用吸管輕輕吹打混勻，按傳代比例接種T25培養瓶傳代，然后補充新鮮的培養基至5mL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中靜置培養；

4)待細胞貼壁后，培養觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養基。

3. 細胞收貨脫落

1)收集所有細胞懸液，1000rpm，離心5min，保留沉淀；

2)添加0.25%消化液0.5mL至離心管中，重懸沉淀，放置于37℃消化3min(或4℃冰箱靜置5-7min)；消化完向離心管內加入5ml培養基終止消化；

3)經1000rpm，離心5min，丟棄上清，用5ml培養基重懸沉淀，接種于新的培養瓶內；

4)待細胞貼壁后，培養觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養基(37℃預熱)。

5)原瓶內貼壁細胞按正常消化處理。

4. 細胞實驗

因原代細胞貼壁特殊性，貼壁的原代細胞在消化后轉移至其他實驗器皿（如玻璃爬片、培養板、共聚焦培養皿等）時，需要對實驗器皿進行包被，以增強細胞貼壁性，避免細胞因沒貼好影響實驗；包被條件常選用鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2） ，多聚賴氨酸PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%），依據細胞種類而定。懸浮/半懸浮細胞無需包被。