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　　【化工儀器網(wǎng) 項目成果】12月14日，中國科學(xué)院生物物理研究所生物大分子國家重點實驗室孫飛課題組與南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子微生物學(xué)與微生物工程實驗室喬明強課題組合作，在Nature Communications上發(fā)表了題為A cryo-electron microscopy support film formed by 2D crystals of hydrophobin HFBI的研究成果。針對當(dāng)前冷凍電鏡樣品制備過程中普遍存在的由于氣液界面導(dǎo)致的樣品變性、解聚和取向優(yōu)勢問題，該研究報道了一種用基于真菌疏水蛋白HFBI薄膜的新型冷凍電鏡支持膜技術(shù)，為相關(guān)問題提出了有效的解決方案。
 

　　近年來，由于硬件和圖像處理算法上的不斷突破，冷凍電鏡單顆粒技術(shù)已成為研究生物大分子復(fù)合體三維結(jié)構(gòu)的主要研究手段之一，并已達到原子分辨率的水平。冷凍電鏡技術(shù)流程中的關(guān)鍵步驟包括冷凍樣品的制備，將生物大分子樣品快速冷凍在玻璃態(tài)冰中，用于下一步的冷凍電鏡成像。然而，實際研究工作中存在顆粒不進孔、分布不均勻、取向優(yōu)勢嚴(yán)重、蛋白質(zhì)變性等問題，導(dǎo)致無法解析樣品的高分辨率三維結(jié)構(gòu)，成為利用冷凍電鏡解析生物大分子復(fù)合體高分辨率三維結(jié)構(gòu)的瓶頸。近年來的研究逐步明確了該問題的微觀機理是源于傳統(tǒng)冷凍制樣過程中的氣液界面效應(yīng)，生物物理所生物大分子國家重點實驗室章新政課題組近期對于該機理問題開展了研究(Journal of Structural Biology 213, 107783)。孫飛課題組與生物物理所生物成像中心合作，圍繞冷凍電鏡樣品制備技術(shù)，開發(fā)了微孔陣列碳支持膜GiG和微孔陣列非晶鎳鈦合金支持膜ANTA(Progress in biophysics and molecular biology 160, 5-15)，相關(guān)技術(shù)產(chǎn)品用于冷凍電鏡實際研究工作。在上述工作的基礎(chǔ)上，孫飛課題組基于喬明強課題組制備的真菌疏水蛋白HFBI研發(fā)了全新的冷凍電鏡支持膜HFBI-film，可有效解決由于氣液界面效應(yīng)導(dǎo)致的樣品變性、解聚和取向優(yōu)勢問題，提高利用冷凍電鏡技術(shù)解析生物大分子復(fù)合物高分辨率三維結(jié)構(gòu)的通量與效率。
 

　　真菌疏水蛋白是一類由高等絲狀真菌分泌的小分子量蛋白質(zhì)(7-15kDa)，可在菌絲和孢子表面自組裝形成兩親性蛋白膜，在真菌不同發(fā)育階段中起到關(guān)鍵作用。疏水蛋白作為兩親性蛋白質(zhì)，其表面展現(xiàn)出明顯的疏水和親水性區(qū)域，使疏水蛋白成為表面活性最強的蛋白質(zhì)之一。良好的生物相容性、獨特的自組裝特性及高度的成膜穩(wěn)定性使疏水蛋白被廣泛用于食品乳化、藥物遞送、生物材料修飾和生物傳感器等領(lǐng)域。疏水蛋白HFBI是一類由瑞氏木霉生產(chǎn)的II型疏水蛋白，可以在氣液界面處自組裝成單層、高度有序的二維晶體結(jié)構(gòu)(圖1)。
 

　　本研究中，科研人員利用疏水蛋白HFBI自組裝形成的連續(xù)二維晶體薄膜來覆蓋微孔陣列非晶鎳鈦合金膜載網(wǎng)(圖2)，用于冷凍電鏡樣品制備。該載網(wǎng)天然親水，無須做輝光放電處理，通過靜電相互作用吸附蛋白顆粒來克服樣品與氣液界面接觸的問題。該支持膜能夠幫助形成更均勻更薄的玻璃態(tài)冰，背景襯度低，有利于高分辨率和高信噪比的冷凍電鏡成像。研究人員用該載網(wǎng)解析了6種蛋白質(zhì)的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)(圖3)，包括兩個在冷凍電鏡實驗中具有明顯取向優(yōu)勢的蛋白質(zhì)樣品——過氧化氫酶catalase和流感病毒血凝素HA，分子量最小可達64 kDa。結(jié)果表明，該新型冷凍電鏡支持膜載網(wǎng)可以有效解決氣液界面效應(yīng)，對不同分子量的樣品具有廣泛的適用性。此外，研究人員證明了該疏水蛋白膜是通過靜電相互作用來吸附蛋白顆粒，這一相互作用可以改變樣品溶液的pH值來進行調(diào)節(jié)，從而為后期使用該支持膜載網(wǎng)提供了明確的優(yōu)化方向和手段。
 

　　研究工作得到國家重點研發(fā)計劃、中國-瑞士科技合作項目、國家自然科學(xué)基金、中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(B類)和北京市科學(xué)技術(shù)委員會的支持。相關(guān)成果已申請中國發(fā)明專利。該工作的電鏡數(shù)據(jù)收集工作均在生物物理所生物成像中心完成。
 

圖1.真菌疏水蛋白生理功能及HFBI結(jié)構(gòu)示意圖
 

圖2.疏水蛋白支持膜載網(wǎng)的制備流程圖
 

圖3.利用疏水蛋白支持膜載網(wǎng)所解析的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)