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免疫復(fù)合物的純化

閱讀：1526        發(fā)布時(shí)間：2018/6/21
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實(shí)驗(yàn)試劑

 

裂解緩沖液

抗體

蛋白A或蛋白G微球(用含0.02％疊氮鈉裂解緩沖液配成10％(V／V)的混懸液，4℃保存)

不含DTT的Laemmli樣品緩沖液(2％SDS、10％甘油、60mmol／LTris，pH6.8和0.02％溴酚藍(lán))

1mol／LDTT(保存于-20℃)

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

 

搖床、抽吸裝置(大多是通過導(dǎo)管與負(fù)壓瓶一室內(nèi)真空器連接)

實(shí)驗(yàn)步驟

 

1．準(zhǔn)備工作

蛋白A或蛋白G微珠混懸液可在用前準(zhǔn)備，4℃保存于含疊氮鈉的溶液中。

2．操作步驟

   1) 將小量裂解物樣本分別置于適當(dāng)數(shù)量的1.5mlEP管中，加入裂解緩沖液，至終體積接近0.5 mol。加入抗血清(1ul)、雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液(50ul)或小鼠腹水(0.5ul)作為抗體的起始用量。滴定時(shí)抗血清用0.5-5ul，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液用10～100ul，腹水用0.1～1.0ul。

   2) 冰上孵育1h。高親和力的結(jié)合反應(yīng)在1h內(nèi)完成。因而，1h的孵育時(shí)間可使大部分的抗體完成反應(yīng)。

   3) 在抗體-抗原反應(yīng)液中加入100ul蛋白A或蛋白G微球(用裂解緩沖液配制成10％混懸液)，4℃搖動(dòng)孵育1h。

盡管有些操作手冊(cè)建議反應(yīng)過夜，但實(shí)際上并無好處，還會(huì)增加背景，因此不主張反應(yīng)過夜，除某些特殊情況外。

在每一步操作的后，盡可能*去除洗滌緩沖液，有利于降低背景。建議在真空泵吸氣管末端使用23號(hào)針，或用微量加樣槍頭以減慢流速，控制微球，如果槍頭很小可直接插入微球中去除洗滌緩沖液。若微球黏附針孔，在管壁上輕彈即可去除。

4) 以10000g，4℃離心15s，收集微球。用裂解緩沖液清洗免疫復(fù)合物3次。裂解產(chǎn)物和洗滌緩沖液很容易通過抽吸法除去。

5) 盡可能*吸去后一次的洗滌液，將免疫復(fù)合物用于相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。

用于SDS-PAGE時(shí)，加入50ul Laemmli樣品緩沖液(2％SDS、10％甘油、100mmol／LDTT、60mmol／LTris，pH6.8和0.01％溴酚藍(lán))，加熱10min，離心，吸取上清液，將其作為樣品加入凝膠內(nèi)進(jìn)行電泳。若暫不進(jìn)行凝膠電泳，可將樣本置于-20℃保存。

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